NATURAL INCIDENCE OF GLIOTOXIN AND A. fumigatus TOXICITY FROM SILAGE AND FINISHED FEED INTENDED TO ANIMALS

GABRIELA PENA; CARINA PEREYRA; ANA DALCERO; STELLA CHIACCHIERA; CARINA MAGNOLI; ROSA CARLOS; CAVAGLIERI LILIA

Florianopolis

Congreso; Congreso Higienistas de alimentos; 2009

INCIDENCIA NATURAL DE GLIOTOXINA Y TOXIGENICIDAD DE CEPAS DE A. fumigatus AISLADAS DE ENSILAJE Y ALIMENTOS TERMINADOS DESTINADOS A ANIMALES DOMÉSTICOS Y MASCOTAS. NATURAL INCIDENCE OF GLIOTOXIN AND A. fumigatus TOXICITY FROM SILAGE ANDD FINISHED FEED INTENDED TO ANIMALS Pena G.A1, Pereyra C.M1, Dalcero A.M1, Chiacchiera S.M2, Magnoli C.1, Rosa C.A.R3, Cavaglieri L.R1 Palabras clave: gliotoxina, A. fumigatus, alimentos de animales Introducción: Aspergillus fumigatus es uno de los contaminantes más frecuentes de alimentos ensilados. En estudios previos se demostró la presencia de A. fumigatus en ensilajes (Cavaglieri y col., 2005; Pereyra y col., 2008a) y alimentos terminados destinados a cerdos, pollos, equinos y mascotas (Pereyra y col., 2007, 2008b, González Pereyra y col., 2008). La exposición a las esporas de A. fumigatus puede resultar en infecciones fúngicas particularmente en órganos expuestos a la invasión externa como las vías aéreas, la glándula mamaria y el útero. La gliotoxina (Gli), metabolito producido por A. fumigatus es un potente inmunosupresor con efectos genotóxicos, citotóxicos y apoptóticos. A pesar de su toxicidad reconocida, es escasa la información disponible acerca de la presencia de A. fumigatus como así también la producción y estabilidad de Gli en ensilaje y alimentos terminados. Objetivos 1- Determinar la producción de Gli por cepas de A. fumigatus aisladas de ensilaje y alimento terminado destinados a bovino, cerdos, pollos, equinos y mascotas. 2- Evaluar la incidencia natural de Gli en estos substratos. Materiales y Métodos Producción de Gli por cepas de A. fumigatus: las cepas se sembraron en agar YES a 37°C, 7 días. Tres taquitos de agar del área central y periférica de la colonia, se pesaron e introdujeron en un Eppendorf. Se adicionó 1 mL de cloroformo, la mezcla solvente-muestra fue centrifugada por 20 min. a 14000 rpm., el sobrenadante fue filtrado y evaporado a sequedad bajo N2. El residuo fue resuspendido en fase móvil, 1% ácido acético en agua-acetonitrilo (3:1), e inyectado en el HPLC. El límite de cuantificación de la técnica fue de1,5 µg/g. Estudio de la incidencia natural de Gli: a partir de 10 gramos de cada muestra se realizó la extracción de la toxina con 10 mL de agua destilada y 40 mL de diclorometano. La mezcla sustrato-solvente se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 hs, transcurrido este período, se agitó por 30 min en un agitador rotatorio. El extracto se filtró, se tomaron 5 mL, se dejó evaporar a sequedad bajo N2. El extracto seco se resuspendió en 200 µl de fase móvil. El análisis se realizó siguiendo la metodología descripta anteriormente. Resultados y discusión: Estudio del perfil toxicogénico: se analizaron 34 cepas de A. fumigatus. La mayor concentración (20,01 µg/g) se obtuvo del 38,4% de cepas aisladas de alimento terminado destinado a mascotas, mientras que la menor concentración de Gli (10,81 µg/g) producida fue a partir del 60% de cepas de alimento terminado destinado a equinos. El 28,5% de las cepas aisladas de muestras de ensilaje produjeron en promedio 14,32 µg/g de Gli. No se hallaron niveles detectables en cepas aisladas de alimento terminado destinado a cerdos y pollos (Tabla 1). Análisis de la incidencia natural de Gli las muestras de ensilaje destinado a bovinos de cría intensiva no presentan niveles de contaminación natural con Gli. De los alimentos terminados, los que mostraron mayor frecuencia de contaminación (41,6%) fueron los destinados a la producción avícola, que presentaron niveles promedio de 70,1 µg/g. Las muestras de alimento terminado destinado a cerdos estuvieron contaminadas en niveles que variaron entre 36,7 y 151,2 µg/g, con una frecuencia de contaminación del 30%. Se encontraron niveles naturales de Gli de 209,1 ± 299,8 y 29,4 ± 0,88 µg/g (Media ± DS) en el 40 y 17,6% de las muestras de alimento terminado destinado a equinos y mascotas, respectivamente (Tabla 2). Se observó una correlación positiva entre la capacidad de producir Gli por cepas de A. fumigatus y la contaminación natural en alimentos terminados destinados a equinos y mascotas, mientras que en ensilaje y alimentos terminados destinados a cerdos y pollos la presencia de dicha toxina y la capacidad de cepas toxicogénicas mostraron una correlación negativa. No existen niveles recomendados de ésta toxina en alimentos destinados a la producción animal, sin embargo se han observado efectos in vitro inmunosupresivos y apoptóticos con concentraciones menores a 0,01 µg/mL (Upperman y col., 2003; Watanabe y col., 2003). Belkacemi y col. (1999) han mostrado que concentraciones de 0,2 mg de gliotoxina disminuye el movimiento ciliar y daña el epitelio de la mucosa respiratoria; por esta razón se considera que al ser producida in vivo, ayuda al hongo a lesionar las vías respiratorias, pero es importante señalar que la producción de la toxina tiene como condición la infección activa del hongo. Conclusión: las cepas de A. fumigatus que presentaron capacidad toxicológica para la producción de Gli lo hicieron en altos niveles. La Gli fue encontrada en concentraciones significantes en todos los alimentos terminados. La contaminación de alimentos destinados a la producción animal con A. fumigatus y la producción de Gli plantean un riesgo potencial que puede afectar la productibilidad y la salud de los animales consumen dicho alimento. Tabla 1. Producción de gliotoxina por cepas de A. fumigatus aisladas a partir de ensilaje para bovinos destinados a cría intensiva y de alimento terminado destinado a la producción porcina, avícola, y a equinos y mascotas. Gliotoxina Muestras de ensilaje y alimento terminado Bovinos Cerdos Pollos Equinos Mascotas Cepas productoras/ total de cepas Media ± DS (µg/g) 4/14 14,32 ± 9,54 0/1 ND 0/1 ND 3/5 10,81 ± 1,12 5/13 20,01 ± 13,55 DS: Desvío Standard, ND: No Detectado. Tabla 2. Concentraciones de gliotoxina (µg/g) y frecuencia de contaminación (%) en alimentos destinados a animales domésticos y mascotas. Muestras de ensilaje y alimentos terminados Media ± DS (µg/g) Frecuencia de contaminación con gliotoxina (%) Bovinos Cerdos Pollos Equinos Mascotas ND 96,6 ± 57,4 70,1 ± 26,9 209, 1 ± 299,8 29, 4 ± 0,9 0 30 42 40 18 DS: Desvío Standard, ND: No Detectado, Límite de cuantificación: 1,5 µg/g. Bibliografía: Cavaglieri L.R., González Pereyra M.L., Pereyra C.M., Magnoli C.E., Chulze S.N., Dalcero A.M. (2005). Reducing impact of mycotoxins in Tropical Agriculture. Ghana, Africa. Pereyra C.M., Alonso V.A., Rosa C.A.R., Chiacchiera S.M., Dalcero A.M., Cavaglieri L.R. (2008b). World Mycot J 1, 457-462. Carina M. Pereyra, Lilia R. Cavaglieri, Stella M. Chiacchiera, Ana M. Dalcero. Revista Argentina de Microbiología. Vol. 39, supl. 1. ISSN 0325-7541. 2007 Pereyra C.; Pena G.; Cavaglieri L.; Alonso V., Chiacchiera S.; Dalcero A (2008b) Revista de Ciencias da Vida. V. 28 Belkacemi L, Barton RC, Hopwood V, Evans EG. (1999) Med Mycol 37: 227-233. Watanabe, A., Kamei, K., Sekine, T.,Waku, M., Nishimura, K., Miyaji, M., Kuriyama, T. (2003). Immunosuppressive substances in Aspergillus fumigatus culture filtrate. J. Infect. Chemother. 9, 114–121. Gonzalez Pereyra M.L., Keller K.M., Tisser a J.L., Ros a C.A.R., Magnoli C.E., L.R. Cavaglieri, A.M. Dalcero (2008). Mycobiota and mycotoxins of equine feedstuffs in central argentina. ANIFEE-08-1934.