Estudio de la localización subcelular de la nucleósido difosfato quinasa canónica de Trypanosoma cruzi.

MARIANA R. MIRANDA, LEÓN A. BOUVIER, MARÍA DE LOS MILAGROS CÁMARA Y CLAUDIO A. PEREIRA

Mar del Plata

Congreso; IX Congreso Argentino de Protozoología y Enfermedades Parasitarias; 2011

sociedad argentina de protozoologia

Las nucleósido difosfato quinasas (NDPKs) son enzimas que catalizan la transferencia de fosfatos de alta energía desde nucleósidos trifosfato a nucleósidos difosfato. Si bien cumplen un rol en la homeostasis intracelular de nucleótidos, también participan en numerosos procesos celulares y por esta razón son consideradas enzimas multifuncionales. TcNDPK1 es una NDPK del parásito Trypanosoma cruzi descripta recientemente por nuestro laboratorio que reúne todas las características de las NDPKs, tiene además actividad de nucleasa, se une a secuencias de ADN y participa en mecanismos resistencia a drogas tripanocidas. Debido a que TcNDPK1 parece ser una enzima con múltiples funciones y a que su localización, en parte, puede conducir al estudio de la función, en este trabajo abordamos el estudio de la localización subcelular de la TcNDPK1 mediante técnicas de microscopía de fluorescencia y electrónica y la generación de proteínas de fusión. Los primeros estudios realizados consistieron en la obtención de parásitos transgénicos que expresaban la fusión TcNDPK1-eGFP. A partir de estos parásitos observamos una señal que provenía de la región anterior del parásito dando un patrón similar a una localización en la vacuola contráctil; a su vez, algunas señales eran tan grandes e intensas que permitían distinguir estructuras particuladas cuando se observaba bajo microscopía de contraste de fase. Sin embargo, no hubo co-localización con marcadores de dicha organela. Mediante microscopía electrónicas determinamos que las estructuras percibidas carecían de membrana y tenían una electrodensidad diferente al de la vacuola contráctil. Las fusiones con otras proteínas fluorescentes monoméricas y a epítopes más pequeños como el HA tuvieron una distribución citosólica completamente diferente a la previamente encontrada. Finalmente, una vez obtenidos anticuerpos específicos contra la TcNDPK1, mediante inmunofluorescencias, logramos establecer una localización principalmente citosólica y perinuclear. De acuerdo con los resultados obtenidos concluimos que el fenotipo observado con la fusión a eGFP consistió en un “artefacto” generado tanto por la dimerización de la proteína fluorescente como por la naturaleza hexamérica de la TcNDPK1. Por lo tanto, el estudio de la localización subcelular de una determinada enzima no siempre puede ser abordado mediante la fusión a proteínas fluorescentes puesto que puede llevar a resultados erróneos. Por otro lado, es posible sugerir una participación de la TcNDPK1 en procesos de reparación de ácidos nucleícos o regulación de la transcripción debido a la posible conexión entre la localización perinuclear de la TcNDPK1 con su actividad nucleasa y unión a secuencias de ADN previamente descriptas.