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Título:

Optimizacion de la degradacion de HAPs por Pseudomonas plecoglossicida mediada por acetogeninas annonáceas aisladas de Annona cherimolia

Autor/es:

EDUARDO ALBERTO PARELLADA; ELENA CARTAGENA ; ALICIA BARDÓN; ADRIANA NESKE

Reunión:

Congreso; XVIII Simposio nacional de quimica organica; 2011

Resumen:

OPTIMIZACIÓN DE LA DEGRADACIÓN DE HAPs POR Pseudomonas plecoglossicida MEDIADA POR ACETOGENINAS ANNONÁCEAS AISLADAS DE Annona cherimolia Eduardo Alberto Parellada1, Elena Cartagena1, Alicia Bardón1,2, Adriana Neske1 1Instituto de Química Orgánica, Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia. Universidad Nacional de Tucumán, Ayacucho 471. Tucumán (4000). Argentina. E-mail: aneske@fbqf.unt.edu.ar 2INQUINOA-CONICET, Tucumán, Argentina. Las acetogeninas annonáceas (ACG) son metabolitos secundarios aislados exclusivamente de especies de la familia Annonaceae, que derivan de la biosíntesis de acetil CoA, en la vía de los poliacetatos. Se caracterizan por presentar un esqueleto común formado generalmente por 35 a 37 átomos de carbono, en el que se destaca una larga cadena alquílica cuyo extremo terminal presenta habitualmente una g-metil-g-lactona a,b-insaturada. En posición 2 de la cadena hidrocarbonada unida a la lactona, aparece generalmente uno, dos, o más raramente, tres anillos tetrahidrofuránicos (THF) y pueden encontrarse funciones oxigenadas y dobles enlaces. Hoy se han descripto más de 400 ACG.1 Estos compuestos comparten estructuralmente con los autoinductores bacterianos grupos γ-lactonas, los que cumplirían un importante rol en el mecanismo quórum sensing que dispara la formación de biofilms. Además se ha reportado que son capaces de interaccionar con las membranas, lo que les da una variada actividad biológica. La cepa Pseudomonas plecoglossicida J262 fue aislada de sedimentos de la costa patagónica argentina mediante enriquecimiento selectivo con naftaleno, como única fuente de carbono y energía. Su capacidad degradadora se demostró mediante ensayos de crecimiento en medio mineral adicionado de naftaleno. Posee un metabolismo respiratorio no fermentativo3 y tiene la capacidad de formar biofilm4 mediante un mecanismo dependiente de la densidad celular denominado quórum sensing en donde intervienen autoinductores bacterianos de tipo 1.5 Investigaciones previas realizadas en nuestro laboratorio mostraron que Pseudomonas plecoglossicida J266 y P. aeruginosa PA1007 estimularon la formación de biofilm cuando se añade la ACG squamocin al medio de cultivo en bajas concentraciones (2,5 µg/ml). El biofilm es una comunidad microbiana de células sésiles que están ancladas a un sustrato o la interfaz de otras bacterias, incrustadas en una matriz de sustancias poliméricas extracelulares de naturaleza polisacárida, que ellas mismas producen y que exhiben un fenotipo alterado con respecto a las células planctónicas, en relación a la tasa de crecimiento y transcripción de genes8. La biorremediación mediada por biofilm es una alternativa segura y eficiente porque las células en biofilm están protegidas dentro de la matriz, presentando mejores posibilidades de adaptación y supervivencia, especialmente, durante períodos de estrés.9 Los HAPs son una clase de compuestos orgánicos hidrofóbicos constituidos por dos o más anillos aromáticos fusionados que pueden provenir de muchas fuentes y encontrarse dispersos en el medio ambiente, incluyendo el aire, el agua y el suelo. Debido a sus propiedades cancerígenas, mutagénicas y tóxicas, algunos de los HAPs se consideran contaminantes prioritarios para la remediación por la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos (EPA) y la Agencia Europea de Medio Ambiente.10 En la actualidad, su degradación microbiana ha alcanzado gran relevancia. Entre los HAPs el naftaleno se ha tomado comúnmente como compuesto modelo en los estudios de biodegradación.11 Estudios realizados en nuestro laboratorio indican que las ACG estimulan la producción de biofilm mediante la generación de un incremento en la producción de autoinductores bacterianos de tipo 1 por parte de la cepa remediadora. Este incremento estaría relacionado al stress ocasionado por la ACG sobre la bacteria, posiblemente a nivel de la membrana. En ensayos realizados con cepas reporteras de quórum sensing ninguna de las ACG evidenció comportarse como AI bacteriano a pesar de la analogía estructural existente.5 En el presente trabajo estudiamos la cinética de degradación de naftaleno por P. plecoglossicida J26 y su relación con la cinética de formación de biofilm mediada por las ACG bis-THF squamocin y laherradurin (Fig. 1). Figura 1. Estructura de las ACG squamocin y laherradurin El ensayo de formación rápida de biofilm está basado en la habilidad de las bacterias para formar biofilm sobre microplacas de poliestireno.7 Para medir la formación rápida de biofilm se colocan 170 ml de medio Luria-Bertani (LB, Cabeo, Rockville, MD, USA) y 10 ml de una solución etanólica (50 mg/ml) de cada compuesto en cada well. Luego, se inoculan 20 ml de un cultivo LB overnight de la cepa biodegradadora utilizada en el ensayo. A continuación, se incuban las microplacas a 30ºC y se cuantifica la formación de biofilm a diferentes tiempos. Los experimentos se realizan por triplicado para cada tiempo y con pruebas controles sin la adición de la ACG. Después de la incubación se adiciona cristal violeta. Luego, se elimina el sobrenadante para dejar sólo el biofilm adherido a las paredes de los wells. El biofilm se remueve por la adición de 200 ml de una solución etanólica al 95% y se mide la absorbancia a 560 nm en un lector de microplacas. Las medidas son determinadas cada hora durante 12 h. Para determinar la cinética de degradación de naftaleno por la cepa biorremediadora P. plecoglossicida J26 en presencia de una solución de squamocin y laherradurin a 2.5 µg.ml-1 se cuantifica el naftaleno residual a diferentes tiempos de incubación durante 6 h y se compara con los valores obtenidos al utilizar la misma cepa en ausencia de ACG. Para ello, se sacrifican dos frascos con 5 mL de cultivo (uno control y otro con ACG) cada hora. A ambos se les agrega 250 µL de una solución stock de acenafteno 10 mM en metanol como estándar interno y 45 mL de metanol bidestilado. Finalmente, se separan las células con un filtro de 0.2 µm de nitrocelulosa y se guardan las muestras a -20°C hasta su inyección en un cromatógrafo líquido-líquido con columna fase reversa (RP-HPLC). Para la cuantificación del naftaleno residual12 se usa una columna C8 con metanol/agua (9:1) como solvente a un flujo de 1.5 mL.min-1 y detector UV/visible (l=276 nm). El área del pico se calcula con un analizador (Total Chrom analyser) y las concentraciones se estiman comparando con el área del estándar interno utilizado (acenafteno). El tratamiento con laherradurin a 2,5 µg.mL-1 incrementó la producción de biofilm de P. plecoglossicida en un 38% a las 6 h de incubación con respecto al control, mientras squamocin incrementó un 47%. El consumo de naftaleno a las 6 h mostró diferencias significativas (p<0.05) entre el control y el tratamiento con laherradurin (16 y 43%, respectivamente) (Fig. 2). Estos resultados son semejantes a los obtenidos previamente con squamocin (18% de consumo en el control y 43% en el tratado). La velocidad de degradación para el control fue de 15 μg.h-1 mientras que, para laherradurin y squamocin fue de 36 y 38 μg.h-1, respectivamente. El análisis de los resultados muestra que el consumo y el aumento de la velocidad de degradación de naftaleno por P. plecoglossicida, en presencia de ambas ACG, se incrementa con la producción de biofilm. Figura 2. Cinética de formación de biofilm de P. plecoglossicida J26 ycinética de consumo de naftaleno en presencia y ausencia de laherradurin Podemos concluir que el agregado de ACG a un cultivo de la cepa biorremediadora P. plecoglossicida optimiza la degradación de HAPs, lo que constituye una estrategia a considerar en protocolos de biorremediación. Referencias 1. Bermejo, A.; Figadere, B.; Zafra-Polo, M.C.; Barrachina, I.; Estornell, E.; Cortés, D.; Nat. Prod. Rep. 2005, 22, 269-303. 2. Riva Mercadal, J.P.; Isaac, P.; Siñeriz, F.; Ferrero M.; Journal of Basic Microbiology. 2010, 50, 290-293. 3. Nishimori, E.; Kita-Tsukamoto K.; Wakabayashi, H.; International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2000, 50, 83-89. 4. Li, M.Y.; Zhang, J.; Lu, P.; Xu, J.L.; Li, S.P.; Pedosphere. 2009, 19, 554-561. 5. Parellada, E.; Ramos, A.N.; Ferrero, M.; Cartagena, E.; Bardón, A.; Valdez, J.C.; Neske, A.; Aceptado International Biodeterioration & Biodegradation IBB-D-11-00080. 6. Parellada, E.; Ferrero, M.; Bardón, A.; Cartagena, E.; Neske, A. VII Congreso Argentino de Microbiología General SAMIGE del Bicentenario 2011. 7. Cartagena, E.; Álvarez Colom O.; Neske, A.; Valdez, J.C.; Bardón, A.; Chemical and Pharmaceutical Bulletin. 2007, 55, 22-25. 8. Rodney, M.; Donlan, L.; Costerton, J.W.; Clinical Microbiol. Rev. 2002, 15, 167-193. 9. Decho, A.W.; Continental Shelf Research. 2000, 20, 1257-1273. 10. Smith, J.R.; Nakles, D.V.; Sherman, D.F.; Neuhauser, E.F.; Loehr, R.C.; III International Conference on New Frontiers for Hazardous Waste Management, U.S. Environmental Protection, Agency Washington D.C. 1989, 397-405. 11. Johnsen, A.R.; Wick, L.Y.; Harms, H.; Environmental Pollution. 2005, 133, 71-84. 12. Manohar, S.; Kim, C.K.; Karegoudar, T.B.; Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001, 55, 311316.

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