Informe técnico

URBIETA, M. S.; HIPPERDINGER, M.; DONATI, E. R.

2017-07-01/2017-07-14

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Biológica

Rec.Nat.No Renov.-Petroleo crudo y gas natu

ObjetivoObtener ADN y amplificaciones del gen 16S ARN ribosómico de cultivos de microorganismos tiosulfato reductores obtenidos previamente a partir de muestras proporcionadas por la empresaProcedimiento experimentalSe realizó la extracción de ADN de tres repiques diferentes de cultivos de microorganismos tiosulfato reductores obtenidos a partir de la misma muestra ambiental original. Los tres cultivos se obtuvieron en las mismas condiciones, tal cual se describió en informes anteriores: medio mineral marino suplementado con Na2S2O3 10 mM, glucosa 10 mM y NaCl 10% y solución de anaerobiosis, incubados a 30°C por al menos 20 días hasta aparición visible de precipitado negro y observación de abundante cantidad de células en el microscopio óptico.Para la extracción de ADN se hicieron pellets de las células presentes en 10 mL de cultivo por centrifugación (13.300 rpm por 15 minutos) de 2 mL de cultivo ´por vez descartando el sobrenadante y evitando tomar el precipitado negro. La extracción de ADN se realizó utilizando el protocolo de CTAB. La concentración del ADN obtenido se determinó por absorción a 260 nm utilizando un espectrofotómetro NanoDrop. Las amplificaciones por PCR del gen 16S ARNr se realizaron utilizando distintos cebadores. Para todas las amplificaciones realizadas se incluyeron un control positivo, utilizando un ADN molde capaz de amplificar con los cebadores correspondientes a cada reacción y un control negativo donde el ADN molde se fue reemplazado por agua calidad biología molecular para descartar contaminaciones en reactivos o durante el procedimiento.Las amplificaciones fueron chequeadas mediante electroforesis en gel de agarosa 1,2% con agregado de bromuro de etidio para la tinción del ADN y observación bajo luz UV.