?Eosina, una sonda fluorescente que permite identificar conformaciones en la Ca2+-ATPasa de membrana plasmática

IRENE MANGIALAVORI; BALBI A; MARIANELA DALGHI; MARIELA FERREIRA-GOMES

Jornada; ? 155° Jornada científica de la Academia de Farmacia y Bioquímica; 2011

Academia Nacional de Farmacia y Bioquímica

La bomba de Ca2+ de membrana plasmática (PMCA) es una proteína transmembrana que acopla el transporte de Ca2+ hacia el medio extracelular con la hidrólisis de ATP. Su funcionamiento es esencial para el mantenimiento de la baja concentración de Ca2+ intracelular. El objetivo de este trabajo es estudiar cambios conformacionales de la PMCA mediante cambios en la fluorescencia de la eosina Y. La eosina Y es un potente inhibidor reversible de la PMCA vinculado con el sitio de unión a ATP. Hemos ensayado la acción de eosina sobre una preparación de PMCA purificada de eritrocitos humanos. Los resultados muestran que la incorporación de PMCA al medio con eosina aumenta la fluorescencia y produce una modificación del máximo de excitación de 527 a 534 nm y de emisión de 540 a 546 nm. La incorporación de Ca2+ genera un aumento adicional de la fluorescencia. El agregado de 1 mM ATP a un medio con PMCA y 0.05 µM eosina produce una disminución de la fluorescencia al nivel del blanco, tanto en presencia como ausencia de Ca2+. La actividad Ca2+-ATPasa en función de la concentración de eosina mostró una inhibición hiperbólica cuya Ki aumenta con la concentración de ATP. Los resultados sugieren que la eosina permite medir cambios conformacionales de la PMCA inducidos por ATP y Ca2+ lo que permitiría seguir las variaciones estructurales durante el transporte de Ca2+ mediante medidas de fluorescencia en tiempo real.