Reactivos lipídicos fotoactivables para el análisis de las transiciones conformacionales de P-ATPasas

JUAN PABLO ROSSI; IRENE MANGIALAVORI; MARIELA FERREIRA GOMES; MARIANELA DALGHI; MARÍA FLORENCIA PIGNATARO

Buenos Aires

Simposio; • XL. Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica (SAB); 2011

Sociedad de Biofísica Argentina

Las proteínas de membrana constituyen más del 20% del total de proteínas, sin embargo solo unas 300 estructuras han podido resolverse por cristalografía. Un grupo importante de proteínas integrales de membrana son las ATPasas transportadoras de iones. Estas pertenecen a la familia de las P-ATPasas, que comparten en común la formación de un intermediario estable en medio ácido como parte de su ciclo de reacción. La información cristalográfica disponible se reduce a diferentes conformaciones de la bomba de Ca2+ del retículo sarcoplásmico y a un par de estructuras de la H+-ATPasa y de la Na,K-ATPasa. Nuestro principal interés ha sido obtener información estructural de la bomba de Ca2+ de la membrana plasmática (PMCA). Esta bomba es una parte integral del mecanismo de señales de Ca2+. Está regulada por calmodulina, que activa la proteína mediante su unión a un sitio autoinhibitorio cambiando la conformación de un estado inhibido a otro activado. La obtención de cristales de PMCA es particularmente dificultosa dado que no existe una fuente natural abundante de esta proteína, se combina con otras isoformas en el mismo tejido y es altamente polimórfica, propiedades que complican la obtención de una muestra homogénea adecuada para su cristalización. Este hecho nos indujo a desarrollar y emplear diferentes técnicas para analizar proteínas como la PMCA, es decir aquellas naturalmente escasas y en baja concentración. La información acerca de la estructura y el armado del dominio transmembrana de una proteína integral puede obtenerse del análisis de las interacciones lípido–proteína. Como veremos en este trabajo, mediante diferentes métodos y sondas hidrofóbicas fotoactivables podemos estudiar interacciones no-covalentes entre la PMCA y los fosfolípidos circundantes en diferentes condiciones experimentales que conducen a conformaciones cinéticamente conocidas. Esta metodología puede aplicarse a otras bombas y proteínas de membrana para analizar bajo un enfoque distinto su comportamiento conformacional.