na, una sonda fluorescente que permite detectar cambios conformacionales en la Ca2+-ATPasa de membrana plasmática

MARIELA FERREIRA-GOMES; IRENE MANGIALAVORI; BALBI A; ROLANDO ROSSI; JUAN PABLO ROSSI

Buenos Aires

Congreso; ? XL. Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica (SAB); 2011

Sociedad de Biofísica Argentina

La bomba de Ca2+ de membrana plasmática (PMCA) es una proteína transmembrana que transporta Ca2+ hacia el medio extracelular acoplado a la hidrólisis de ATP. Durante su funcionamiento atraviesa diferentes conformaciones que afectan regiones citoplasmáticas y segmentos transmembrana. El objetivo de este trabajo es estudiar cambios conformacionales de la PMCA utilizando la eosina Y como sonda fluorescente. La eosina Y es un potente inhibidor de la PMCA vinculado con el sitio de unión a ATP. Hemos estudiado el efecto inhibitorio de la eosina sobre la bomba y evaluamos variaciones de la fluorescencia de esta sonda unida a la PMCA en diferentes condiciones experimentales que producen cambios conformacionales. Los resultados muestran que la incorporación de PMCA al medio con eosina aumenta la fluorescencia y produce una modificación del máximo de excitación de 527 a 534 nm y de emisión de 540 a 546 nm. El agregado de Ca2+ a la bomba genera un aumento adicional de la fluorescencia. La adición de 1 mM ATP o ADP a un medio con PMCA y eosina produce una disminución de la fluorescencia tanto en presencia como ausencia de Ca2+. La actividad Ca2+-ATPasa en función de la concentración de eosina mostró una inhibición hiperbólica cuya Ki aparente aumenta linealmente con la concentración de ATP. Estos resultados sugieren que la eosina permitiría medir cambios conformacionales de la PMCA inducidos por ATP y Ca2+ que pueden ser utilizados para detectar variaciones estructurales durante el transporte de Ca2+ mediante medidas de fluorescencia en tiempo real.