Estudio topológico e identificación de amino ácidos involucrados en la actividad catalítica de la Delta 5 Desaturasa de lípidos de membrana de Bacillus subtilis

DIAZ, ALEJANDRA R; MANSILLA, C; DE MENDOZA, D

Buenos Aires

Congreso; Congreso Argentino de Microbiología; 2001

Asociacion Argentina de Microbiologia

La expresión del sistema de desaaturacion de acidos graos esterificados a lípidos de membrana empleado por B. subtilis es inducible a bajas temperaturas de crecimiento. Nuestro grupo de trabajo ha aislado y caracterizado el gen des de B. subtilis que codifica para una Delta 5 desaturasa de acil lípidos (Des), de 352 residuos aminoacidicos, con un peso molecular estimado de 42 KDa, que contiene los tres grupos de histidina (His), conservados en otras desaturasas de membrana. El análisis de la secuencia primaria muestra que Des es una proteína altamente hidrofobica, con 6 putativos segmentos transmemrana (STM). Los objetivos del presente trabajo fueron estudiar a topología de la proteína Des y analizar el significado funcional de los residuos de His. Para definir la topología se construyeron proteínas quiméricas de Des con la proteína fosfatasa alcalina (PA) de E. coli, codificada por el gen poa. Las uniones se hicieron en dominios hidrofilicos que flanquean los putativos STM. La construcción de los genes de fusión fue obtenida clonando segmentos definidos 5' del gen des bajo el promotor inducible T7, en el plasmido de expresión en E. coli pET28A. Luego, se clono el gen poa en la región 3' rio abajo de las distintas construcciones que contienen los fragmentos del gen des. La expresión de los genes de fusión fue confirmada por análisis de Western blot con un anticuerpo monoclonal anti-PA, de extractos de células enteras de E. coli que portan el plasmido con las fusiones. La baja actividad PA de las fusiones Des-PA en las posiciones 74, 187, 230 y 269 indicarían que estos residuos se localizan del lado citoplasmático de la membrana, mientras que la alta actividad de las fusiones en los sitios 48, 51, 205 y213 señalarían una ubicación periplasmatica de los mismos, quedando asi limitados los STM2, STM5 y STM6. Aprovechando la capacidad de esta enzima para desaturar acidos grasos de cadena larga esterificados a lípidos de membrana, se analizo la importancia de distintos residuos de His. Mediante mutagenesis sitio dirigida por la técnica de PCR de extensión superpuesta (SDE-PCR), 7 residuos de His fueron individualmente convertidos a Ala. las mutantes HisAla de las posiciones 80, 116 y 274 fallaron para producir palmitoleato a partir de palmitato, demostrando que estos residuos son esenciales para la función catalítica de Des. También se observo perdida de la actividad enzimática en una mutante con una delecion C-terminal de 58 aa.