DESARROLLO DE ABORDAJES METODOLÓGICOS INNOVADORES PARA LA DETECCIÓN DE POTENCIAL REVERSIBILIDAD DE DAÑO OCULAR EN UN MODELO IN VITRO DE CÓRNEA BOVINA.

BENEDETTI, MARTINA; RIVERO, MARTIN NICOLAS; MARTÍNEZ, ROMINA; LENZE, MARIELA; ROCO, JULIETA; WIKINSKI, SILVIA; GUTIÉRREZ, MARÍA LAURA

Ciudad de México

Congreso; IV CONGRESO LATINOAMRICANOS DE MÉTODOS ALTERNATIVOS - COLAMA 2022; 2022

UNAM

Uno de los requisitos para el registro de productos químicos, domisanitarios y fitosanitarios es realizar una evaluación de riesgo, que incluye aportar evidencia acerca del potencial daño ocular frente a una exposición aguda informando tanto su severidad como datos sobre su reversibilidad. El gold standard para obtener esta información es un ensayo en conejos albinos conocido como test de Draize. Hoy en día esta prueba es criticada por su baja reproducibilidad, por las grandes diferencias entre el ojo del conejo y el humano y por cuestiones éticas. Los métodos alternativos aprobados que la superan en reproducibilidad, sin embargo, no cumplen satisfactoriamente con dos de los objetivos exigidos para las clasificaciones ONU GHS y US EPA: conocer si el daño producido es reversible y en caso de serlo, en qué plazo. El objetivo general entonces es perfeccionar un modelo in vitro que utiliza la córnea bovina como sustrato y que es sensible para predecir si una sustancia es irritante/corrosiva (Bovine Corneal Opacity and Permeability Test o BCOP), complementándolo con una estrategia capaz de predecir si el daño es reversible y en qué plazo.En el daño corneal producido por exposición química, hay dos puntos clave que se pueden identificar y determinarán la reversión del daño producido. En términos fisiopatológicos, los eventos subyacentes a estas anomalías corneales son daño a nivel del epitelio corneal y la desorganización de los componentes del estroma subyacente. En este proyecto nos proponemos estudiar ambos eventos. Por un lado, proponemos evaluar la integridad de las células epiteliales responsables de la regeneración del epitelio corneal, y por otro, cambios en la organización del estroma y la consiguiente opacidad, que pueden ser indicativos de daño a largo plazo.Ante una situación de daño corneal, las células madre epiteliales luego de varias rondas de división y migración, se convierten en células epiteliales diferenciadas que regeneran el tejido afectado. Mediante un cultivo de explanto de córnea bovina nos propusimos estudiar la capacidad de replicación, migración y diferenciación de las células epiteliales y evaluar si las mismas se ven afectadas diferencialmente en respuesta al daño producido por productos químicos de referencia de distintas categorías GHS y EPA. Para ello se cuantificó el crecimiento relativo como el área del halo del explante/el área de expansión total. En resultados preliminares, observamos una correlación entre el área de crecimiento y la categoría de los distintos productos. En un futuro caracterizaremos, mediante inmunocitoquímica, las subpoblaciones de células que conforman el halo de crecimiento luego de ser expuestas a los productos de referencia. Con respecto al daño a nivel del estroma, múltiples estudios evidencian la existencia de una población de células madre estromales mesenquimales (L-MSC) multipotentes presente en el estroma de las córneas humanas y de otros mamíferos. Las L-MSC son capaces de generar tejido estromal in vitro y de promover la cicatrización corneal in vivo por ello cobran importancia a la hora del estudio del fenómeno de reversión del daño corneal. Actualmente logramos estandarizar un protocolo de aislamiento efectivo de L-MSCs que fueron utilizadas en ensayos de citotoxicidad. Próximamente se planea evaluar si los productos de referencia afectan diferencialmente la capacidad de replicación y migración de las células en un ensayo de cicatrización de heridas.Finalmente, nos planteamos establecer un modelo de cultivo organotípico de córnea bovina para estudiar la reversión del daño. Para ello luego de tratar las córneas con distintos productos de referencia se evaluó la evolución del daño en el tiempo. En pruebas preliminares se logró establecer el cultivo de córneas y se observó reversión del daño en el tiempo. En un futuro estudiaremos el balance de las poblaciones celulares del estroma en respuesta a los productos de referencia.Este novedoso proyecto constituye un gran aporte al desarrollo del conocimiento del campo de los métodos alternativos al uso de animales. Al concluir los objetivos propuestos, contaremos con evidencia que permita determinar cuál o cuáles de los abordajes empleados, o qué combinación de los mismos, permite detectar con especificidad la categoría de los productos de referencia de GHS y EPA.