Enterococcus faecalis MR1024, posible candidato a probiótico: estudio de implantación intestinal en ratones BALB/c

CASTRO MS; ANDINO PJ; LAVIGNE MV; CECI MA; SPARO MD; MANGHI MA

Ciudad Autonoma de Buenos Aires

Jornada; 147º Jornada Científica. Academia Nacional de Farmacia y Bioquímica; 2003

Academia Nacional de Farmacia y Bioquímica

Introdución Los probióticos son clásicamente definidos como cultivos de uno o varios microorganismos, que al ser administrados ya sea a los animales o a los humanos, los afecta beneficiosamente. Se han establecido diversos criterios para la selección de estudios de microorganismos probióticos para consumo humano. Los potenciales microorganismos probióticos deben cumplir, entre otros, los siguientes criterios: * demostrar que tienen conducta no patogénica * exhibir resistencia a procesos tecnológicos, a los ácidos gástricos y a la bilis * adherirse al tejido epitelial intestinal * ser capaz de persistir, al menos por cortos períodos, en el tracto gastrointestinal * producir sustancias antimicrobianas Otro pre-requisito para la investigación y desarrollo exitoso de probióticos es el conocimiento acerca de la microflora intestinal indígena que protege contra infecciones ya que el disturbio de esta flora puede incrementar la susceptibilidad a infecciones. Enterococcus faecalis MR1024 es una cepa aislada de un ensilado natural de maíz que produce una bacteriocina con amplio espectro antibacteriano (3). E. faecalis MR1024 no produce factores de virulencia como gelatinasa, no lisa los góbulos rojos humanos de los diferentes grupos sanguíneos y el mecanismo conjugativo no es mediado por feromonas. En este trabajo se estudia la flora microbiana y la capacidad de E. faecalis MR1024 de adherirse y persistir en el tejido epitelial intestinal luego de la administración de este enterococo en ratones BALB/c. MATERIALES Y MÉTODOS Condiciones de cultivo: Un cultivo de 10 ml de E. faecalis MR1024 se propagó en 100 ml de caldo BHI a 35 ºC durante 18 h. Animales: Se emplearon ratones hembra BALB/c de 8 semanas de vida (INTA) que fueron agrupados de a 10 y mantenidos en cuarentena durante 96 h antes de ser tratados. Diseño experimental: Luego de la incubación, el cultivo de E. faecalis MR1024 en caldo BHI se centrifugó 15 min a 6000 rpm, se lavó tres veces con PBS estéril y se prepararon suspensiones de aproximadamente 3.1010 cel/ml; 3.109 cel/ml; 3.108 cel/ml y 3.107 cel/ml, todas en PBS estéril. Se usaron cuatro grupos de ratones, cada uno de ellos recibió durante 3 días consecutivos una administración diaria intragástrica (100 l) de una de las distintas suspensiones de E. faecalis MR1024. A los animales del grupo control se les administró PBS estéril de la misma manera. Recolección de muestras: Tres y 6 días después de la última administración de E. faecalis MR1024, 5 animales de cada grupo fueron sacrificados. Los intestinos se extrajeron de forma estéril, se pesaron, cortaron y desmenuzaron en pequeños pedazos. Los homogenatos obtenidos se trasvasaron a tubos cónicos estériles y se agitaron a 4 ºC durante aproximadamente 20 h. A los 6 días también se tomaron muestras de materia fecal que fueron pesadas antes de su procesamiento. Tratamiento de las muestras: Las muestras de intestinos se homogeneizaron durante 5 min (Stomacher Lab- Blender 400) en buffer fosfato, pH 7,0 (BF). Las muestras de materia fecal se disgregaron con mortero estéril y se disolvieron en agua peptonada estéril 0,1 % p/v (AP). Diluciones seriadas (1:10) de las muestras de intestino (BF) y materia fecal (AP) fueron sembradas en diferentes medios selectivos para el recuento de microorganismos. Recuento de microorganismos: *Enterobacterias: se sembró en profundidad con la técnica de doble capa en agar violeta cristal- rojo neutro- bilis- glucosa y se incubó 24 h a 35 ºC. *Enterococos: se sembró en superficie en agar fluorogénico- gentamicina- talio- carbonato y se incubó 24 h a 35 ºC. Caracterización fenotípica: Se tomaron 10 colonias al azar de los medios selectivos. *Enterobacterias: las colonias violetas rodeadas de un halo de precipitación se confirmaron por tinción de Gram, oxidasa, agar tres azúcares (TSI), citrato de Simmons, lisina decarboxilasa (LDC) y producción de indol. *Enterococos: las colonias se confirmaron por tinción de Gram, catalasa, sistema API 20 Strep (bioMérieux), desarrollo en caldo con NaCl (6,5 %), desarrollo a 10 ºC y 45 ºC, motilidad, producción de pigmento, utilización de piruvato de sodio, tolerancia al telurito (0,04 %), formación de ácido en caldo con rojo fenol y metil--D-glucopiranósido (1 %)  y resistencia a vancomicina (30 g). Búsqueda de E. faecalis MR1024: a las colonias identificadas fenotípicamente como E. faecalis se les realizó la prueba de inhibición por el método de la gota utilizando como bacterias indicadoras Listeria monocytogenes MR101, Staphylococcus aureus MR162 y Escherichia coli MR34. RESULTADOS En las muestras de intestino y de materia fecal todas las enterobacterias estudiadas fueron E. coli. En todos los casos, cuando hubo desarrollo de flora Gram + fueron E. faecalis. Todas las colonias de E. faecalis recuperadas mostraron inhibición con el método de la gota, caracterizándose como E. faecalis MR1024. Se detectó E. faecalis MR1024 en las muestras de materia de fecal de todos los animales inoculados y en las muestras de intestinos de los animales tratados con altas concentraciones de la bacteria. Las UFC/g intestino de E. faecalis MR1024 detectadas a los 3 y 6 días post-tratamiento no mostraron diferencias significativas. En ninguno de los animales tratados se observó signos de diarrea DISCUSIÓN Los resultados ponen en evidencia que a los 6 días posteriores a la administración de E. faecalis MR1024 esta bacteria se mantiene implantada en el tejido intestinal. La inoculación  por vía oral de E. faecalis MR1024 en altas concentraciones no le ocasiona diarrea a los animales, lo cual confirma que este enterococo no posee factores de virulencia. Algunas de las condiciones esenciales para que una bacteria pueda ser utilizada como probiótico son que no posea factores de virulencia y sea capaz de implantarse en el intestino. E. faecalis MR1024 cumple con estos requisitos por lo tanto podría ser un candidato a probiótico. Estos resultados constituyen un incentivo para profundizar los estudios realizados.