Esquema de inmunización alternativo para los antígenos componentes de la vacuna DTP.

LAVIGNE MV; CASTRO MS; ANDINO PJ; MANGHI MA

Curitiba, Brasil

Jornada; Jornadas de Jóvenes Investigadores de la Asociación de Universidades del Grupo Montevideo; 2004

Asociación de Universidades del Grupo Montevideo

Introducción y Objetivo: La vacunación es la medida más efectiva para prevenir la diseminación de muchas enfermedades infecciosas. Con el fin de reducir tiempo y costo en la ejecución de los planes de vacunación y mejorar la aceptación y cumplimiento de los mismos, una de las recomendaciones de la Organización Mundial de la Salud consiste en disminuir el número de inoculaciones empleando vacunas combinadas. Así fue como los componentes tetánico (T) y diftérico (D) fueron combinados con Salmonella typhi (St), Bordetella pertussis entera (Pw), sus antígenos solubles (Pa), H. influenzae tipo b (Hib), polio virus (Salk), o virus de hepatitis B (HBV), para formular vacunas cada vez más complejas, a saber: DT, DTSt, DTPw, DTPa, DTPHib, DTPSalk, DTPHibHBV. Al cambiar las formulaciones de las vacunas se puso énfasis en que cada uno de los componentes mantuviera su capacidad de generar protección luego de ser asociado con otros antígenos, sin investigar posibles efectos de modulación de la respuesta inmune. En nuestro laboratorio, con experiencia en el estudio de la respuesta inmune producida por antígenos bacterianos y diferentes vacunas, recientemente se analizó la respuesta inmune generada por las vacunas DT, DTPw, DTPa y DTSt en un modelo animal con ratones BALB/c. Demostramos que la respuesta antitetánica de tipo humoral (Th2, no inflamamtoria) originada por la inmunización con antígenos solubles (DT, DTPa) se modifica cuando el toxoide tetánico está acompañado con antígenos particulados (DTPw, DTSt), activándose una respuesta Th1, con producción de citoquinas pro-inflamatorias como IL-12, IFNg e IL-6, que no son necesarias para la protección contra tétanos e incluso podrían resultar perjudiciales para individuos susceptibles. También observamos que la nueva vacuna DTPa, de menor reactogenicidad que la tradicional (DTPw) no genera células de memoria con capacidad para proliferar ante el estímulo in vitro con B. pertussis. Esto coincide con las observaciones efectuadas por otros autores que demuestran que la vacunación con DTPa genera una capacidad de depuración de la bacteria que es francamente inferior a la generada por DTPw. Asociando lo expuesto se planteó como objetivo aplicar en ratones BALB/c un plan de vacunación alternativo para obtener respuesta tipo Th2 para los toxoides tetánico y diftérico y respuesta mixta (Th1/Th2) para B. pertussis  (patógeno intracelular).  Materiales y Métodos Plan de inmunización Se efectuaron inoculaciones por via subcutánea según el siguiente esquema : día0 Día 14 día 21 día 28 día 38 Vacuna DT Vacuna Pw Vacuna DTPa Vacuna DTPa obtención desueros y  extracción de bazos En cada ensayo se utilizaron 4 ratones para el grupo control (inoculados con SF) y 4 para el grupo en estudio.  Obtención de muestras Doce días después de finalizado cada plan de inmunización se obtuvieron los sueros (a partir de punción retro-orbital) y se extrajo el bazo de cada ratón. A partir de cada bazo se preparó una suspensión celular en medio RPMI. Se utilizaron placas de poliestireno de 96 pocillos. En cada pocillo, a 100 µl de cada suspensión celular (4x106 células/ml) se le adicionó igual volumen de medio de cultivo, antígeno (toxoide tetánico (T) o Bordetella pertussis  (Pw)) o mitógeno (Concanavalina A). Cada determinación se efectuó por cuadruplicado. Las placas se incubaron a 37 ºC en presencia de 5 % de CO2. En cada experimento se efectuaron dos cultivos celulares en paralelo: uno para evaluar proliferación celular (96 hs de cultivo) y otro para estudiar la presencia de citoquinas en los sobrenadantes (72 hs de cultivo).  Evaluación de proliferación celular Luego de 78 hs de cultivo se adicionó 1 µCi de [3H] timidina en todos los pocillos. A las 96 hs de cultivo se cosecharon las células y se midieron las cpm correspondientes a cada pocillo en un contador de centelleo líquido fijándose un valor de corte definido como las cpm promedio más 2 DS de las células de todos los ratones incubadas sin estímulo.  Evaluación de citoquinas en sobrenadantes de cultivo Cada sobrenadante de cultivo se obtuvo juntando las cuatro réplicas presentes en la placa de cultivo. Se estudiaron por ELISA los niveles de INFg, IL-5, IL-12 (OptEIA, Pharmingen) e IL-6 (R&D) calculando los pg/ml a partir de curvas de referencia confeccionadas con citoquinas recombinantes. Se determinó un valor de corte definido como el valor medio más 2 DS de las células de todos los ratones incubadas sin estímulo.  Determinación de Anticuerpos Los títulos de IgG antitetánica, antidiftérica y antipertúsica se midieron por ELISA. Para determinar la relación IgG1/IgG2a los sueros fueron previamente diluídos para obtener el mismo título de IgG específicas. Se trabajó con dos placas en paralelo para revelar cada una con anticuerpo anti-IgG1 o con anticuerpo anti-IgG2a de ratón (Bethyl laboratories Inc.).  Análisis estadístico Las relaciones IgG1/IgG2a, los niveles de proliferación y los de citoquinas fueron analizados a través de ANOVA.  Resultados y Discusión En todos los casos se produjeron niveles detectables de anticuerpos antipertúsicos, antitetánicos y antidiftéricos. El 100% de los animales inmunizados resultaron respondedores cuando se midió la capacidad proliferativa de las células de bazo en cultivo estimuladas con toxoide tetánico y B. pertussis . Al analizar los niveles de las citoquinas producidas se comprobó que el toxoide tetánico genera respuesta Th2 (IL-5) y B. pertussis  respuestaTh1 (IFNg). Además, recordando que en ratones las repuestas de tipo Th1 favorecen la producción de anticuerpos del isotipo IgG2a y que las repuestas de tipo Th2 inducen la producción de anticuerpos IgG1, el perfil de citoquinas obtenido también se ve reflejado en el hecho de que la relación IgG1/IgG2a de los anticuerpos antipertúsicos fue significativamente menor a la relación IGg1/IgG2a tanto de los anticuerpos antitetánicos como la de los antidiftéricos. Los resultados mostraron que la aplicación del nuevo plan de inmunización evita la producción innecesaria de citoquinas pro-inflamatorias en la respuesta antitetánica y genera una respuesta anti-B. pertussis de tipo Th1, adecuada para la protección contra este patógeno intracelular, observándose además producción de IL-6. A diferencia de lo observado en ensayos anteriores inmunizando con vacuna DTPw, con el plan presentado no se detectó IL-12 en niveles superiores al basal. Muy probablemente FHA, uno de los componentes de la vacuna DTPa que tiene conocida actividad anti-inflamatoria, sea un modulador responsable de esta diferencia. Se podría asumir que el intervalo de 14 días entre las inmunizaciones con DT y con Pw permitió evitar el efecto modulatorio hacia Th2 de los toxoides solubles sobre la respuesta anti-B. pertussis así como también permitió evitar el efecto modulatorio hacia Th1 de B. pertussis sobre la respuesta antitetánica y antidiftérica. De hecho en ensayos anteriores un intervalo de 7 días probó no ser suficiente para lograr esto. Conclusión Los resultados proveen evidencias de que el plan alternativo propuesto es capaz de generar respuestas adecuadas contra los antígenos componentes de la vacuna DTP. Serán necesarios más estudios para evaluar el estado de protección generado por la vacunación según dicho plan y eventualmente su posible incorporación al plan de inmunización infantil.