Efecto de quitosano en el crecimiento in vitro de Thecaphora frezii

DÍAZ MS; RAGO AM; PACCIORETTI MA; PAREDES JA; MERINO MC; FIGUEROA AC

Jornada; XXXV Jornada Nacional de Maní; 2020

EFECTO DE QUITOSANO EN EL CRECIMIENTO IN VITRO DE THECAPHORA FREZIIMerino M.C.1, Paccioretti M.A.1, Díaz M.S.2, Figueroa A.C.2, Paredes J.A.1, Rago A.M.31IPAVE - UFyMA. CIAP-INTA. 2CEPROCOR. 3CIAP-INTAmerino.cecilia@inta.gob.arIntroducciónQuitosano es un biopolímero policatiónico obtenido a partir de la deacetilación parcial de la quitina, y presenta propiedades biológicas únicas que le otorgan un gran potencial de uso tanto en agricultura como en medicina. Este biopolímero no es tóxico para mamíferos y animales superiores, y estimula la respuesta de defensa de las plantas frente a estrés biótico y abiótico. Desde que Allan y Hadwiger en 1979, mostraron por primera vez el efecto antifúngico de quitosano, este biopolímero ha atraído la atención de numerosos investigadores con el propósito de evaluar la sensibilidad de diferentes hongos frente a este compuesto. Se ha visto que quitosano de bajo peso molecular y alto grado de deacetilación es más efectivo para inhibir el crecimiento de hongos patógenos. El objetivo del presente trabajo fue analizar el efecto de quitosano como inhibidor del crecimiento in vitro del hongo Thecaphora frezii, agente causal de la enfermedad del carbón del maní.Materiales y métodosQuitosano es insoluble en agua, por lo que previo a su uso en medio de cultivo se prepararon soluciones madres de quitosano de bajo peso molecular en ácido acético con pH 5,5. El cultivo puro de un aislamiento de T. frezii fue mantenido en placas de APD (Agar Papa Dextrosa), las que se prepararon vertiendo 5 ml de APD en placas petri de 60 mm X 15mm. Las placas con el hongo fueron mantenidas en oscuridad a 25 °C. Para realizar los inóculos en medio líquido, se tomaron discos de 4 mm de diámetro de micelio en activo crecimiento de las placas de APD con T. frezii de 7 días de cultivo, se colocaron en medio líquido CPD (Caldo Papa Dextrosa), se agregaron distintas concentraciones de quitosano de bajo peso molecular, y se incubó en agitación a 25ºC por 3 hs. Al cabo de ese tiempo se eliminó el medio de cultivo, se realizó un lavado con CPD, se agregó medio CPD nuevo y se incubó por 48 hs en agitación a 25ºC. En paralelo se procesaron controles a los que se les agregó el inóculo y ácido acético a la misma concentración que la empleada para diluir quitosano. Luego de 48hs, el medio líquido con el inóculo se colocó en tubos, se centrifugó, luego se descartó el sobrenadante, y se resuspendió en 2ml de CPD. De cada tubo se tomaron 150ul y se colocaron en placa de 96 pocillos aptas para análisis de fluorescencia. Luego se agregó, en cada pocillo de la placa, 50ul de resazurina previamente preparada de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La rezasurina es un colorante redox que, en forma oxidada es de color azul no fluorescente, mientras que al reducirse a resorufina cambia su color a rosa fluorescente. Esta característica hace que resazurina sea de gran utilidad para evaluar actividad metabólica, y por lo tanto dar cuenta de la viabilidad celular. Este colorante tiene la ventaja de ser soluble en agua, no tóxica, y estable en el medio de cultivo. La lectura de la fluorescencia se realizó en un lector de microplacas a una longitud de excitación de 560 nm y una longitud de emisión de 600 nm. El efecto de quitosano para cada concentracion se evaluó por triplicado. El análisis estadístico fue realizado mediante un modelo lineal, y la comparación entre tratamientos se hizo mediante test de Fisher (p