COMPARACIÓN DE DOS TÉCNICAS DE PCR DIAGNÓSTICAS PARA LA DETECCIÓN DE LEPTOSPIROSIS ANIMAL

SARAULLO, VANINA; MARTINEZ, MARA; BRIHUEGA, BIBIANA; GRUNE LOFFLER, SYLVIA; HAMER, MICAELA; WATANABE, OLIVIAA

Encuentro; Primer encuentro virtual de divulgación y comunicación de Ciencias Veterinarias 2020 de la Facultad de Cs. Veterinarias, Universidad Nacional de Rosario. Casilda, 9-11 de diciembre de 2020.; 2020

La leptospirosis es una enfermedad infecto-contagiosa causada por una espiroqueta del género Leptospira spp., que afecta tanto a los animales de compañía y de producción, los cuales actúan como fuente de infección para el hombre. Aquellos animales hospedadores que presentan una infección renal crónica y asintomática funcionan como reservorios, de los cuales los más importantes son los roedores. Estos eliminan leptospiras a través de la orina, favoreciendo la diseminación de esta zoonosis por contaminación de aguas y suelos, siendo el hombre y los animales de producción, hospederos accidentales. La leptospirosis animal genera pérdidas productivas a nivel pecuario, presentándose en forma de abortos, muerte perinatal y/o nacimientos de animales débiles, infertilidad y mastitis en el ganado bovino. La importancia de esta enfermedad como enfermedad pecuaria radica no sólo a nivel económico-productivo, sino también a nivel de la Salud Pública. El método gold-standard para su diagnóstico es el Test de Microaglutinación (MAT) que permite la detección y titulación de anticuerpos cuando se enfrenta el suero muestra a cepas referenciales vivas de leptospiras patógenas1. Esta es una técnica laboriosa que requiere mantener un cepario continuo y ser realizada por personal altamente calificado. Otra desventaja es el requerimiento de analizar una segunda muestra para buscar la seroconversión a los quince días de tomada la primera. En la era de la biología molecular, la Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) ha permitido el desarrollo de variados protocolos de diagnóstico para leptospirosis, pero en la actualidad no existe ningún método molecular validado a nivel internacional y considerado gold-standard. En un trabajo anterior, ya se han puesto a prueba diferentes métodos de extracción de ADN para leptospiras patógenas a partir muestras clínicas, siendo el mejor la resina Chelex-100 (BioRad), el cual presenta una mayor sensibilidad y practicidad a la hora de emplearla2. El objetivo del presente trabajo fue comparar dos técnicas de PCR diagnósticas para leptospirosis animal, en un ensayo controlado. Se utilizó suero y orina bovina contaminados artificialmente con cultivo puro de L. interrogans serovar Pomona en diluciones seriadas. Se estimó la concentración de dicho cultivo por espectrofotometría, teniendo en cuenta que, a la longitud de onda de 420nm, una densidad óptica (OD) entre 0,3 y 0,4 corresponde a 6-9x108 leptospiras/mililitro. Se usó como control negativo las muestras sin contaminar y como control positivo, la cepa pura. Se extrajo el ADN con la resina Chelex-100 a cada dilución y se utilizó para realizar, en primer lugar, la PCR descripta por Gravekamp et al.3 utilizando los primers G1 y G2, que permiten la amplificación de un fragmento de 285pb del gen secY; y, por otro lado, la PCR LipL32, técnica que amplifica una región de 423pb del gen de una proteína de membrana llamada LipL32 presente en las leptospiras patógenas4. Los productos de amplificación se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa 2% teñido con bromuro de etidio. La técnica que presentó la mayor sensibilidad fue PCR LipL32, pudiéndose detectar amplificación hasta la dilución 8 en suero (representando un aproximado de entre 60 y 90 leptospiras/mL) y la dilución 6 en orina (correspondiente a 6-9x103 leptospiras/mL). Mientras que, con la PCR G1G2, se logró amplificar hasta 6-9x104 leptospiras/mL en suero y 6-9x105 leptospiras/mL en orina (Fig. 1). Las técnicas moleculares aquí aplicadas son algunas de las tantas utilizadas en el diagnóstico de leptospirosis animal, debido a la falta de un único método de detección molecular validado como gold-standard. Es por esta razón que es importante conocer la sensibilidad analítica de cada de una de ellas para saber cuál es la mejor opción a la hora de realizar un diagnóstico, además de la correcta elección de la muestra a analizar. Se sabe que las leptospiras son detectables en suero o sangre sólo en los estadíos agudos de la infección, ya que luego éstas se alojan en órganos, como los riñones, momento a partir del cual, se puede detectar la bacteria en orina, aunque su eliminación es intermitente. Esta es la razón por la cual se debe contar con dos resultados positivos con dos métodos de diagnóstico diferentes para poder confirmar un caso de leptospirosis. El empleo de la resina Chelex-100 para la extracción de ADN combinado con PCR LipL32 es una buena metodología para abordar el diagnóstico molecular de leptospirosis animal, siendo el próximo paso su aplicación a una mayor cantidad y variedad de muestras clínicas animales para el análisis de su sensibilidad diagnóstica.