Estudio comparativo de tres PCRs para la detección de ADN de leptospiras patógenas

HAMER, MICAELA; GRUNE LOFFLER, SYLVIA; ESTEBAN, MICAELA; BIBIANA BRIHUEGA; SARAULLO, VANINA; CRISTINA SANCHEZ; MARA MARTINEZ

Jornada; XXII Jornadas de divulgación técnico-científicas; 2022

La leptospirosis es una enfermedad subdiagnosticada a nivel mundial, por los signos clínicos que comparte con otras enfermedades infecciosas. Debido a esto, es necesario contar con herramientas de laboratorio específicas que permitan determinar la presencia del patógeno que causa la enfermedad y así poder dar un diagnóstico certero. La PCR (por sus siglas en inglés Polymerase Chain Reaction) es usada para el diagnóstico clínico de muchas enfermedades, detectando el material genético del microorganismo de interés. En el caso de la leptospirosis animal, existen diferentes PCRs para la amplificación de genes específicos de leptospiras patógenas. En este trabajo se realizó un estudio comparativo de tres PCRs de punto final, que detectan el gen lipl321 y dos regiones del gen ligB2,3 (ligBpet y ligBct). Se utilizó ADN de 22 cepas de leptospiras del Laboratorio de Leptospirosis de INTA Castelar (19 patógenas, 2 no patógenas y 1 intermedia). Los cultivos fueron incubados en medio EMJH a 30°C durante 7 días. El crecimiento bacteriano fue monitoreado bajo un microscopio de campo oscuro hasta alcanzar la escala 2 de McFarland, que corresponde a 2*108 leptospiras/mL (OD420: 0.365). La extracción del ADN fue llevada a cabo utilizando Chelex-1004. Para el análisis de la especificidad analítica, se utilizó ADN genómico de microorganismos patógenos diferentes a leptospira (Brucella abortus, Campylobacter fetus subsp. Fetus, Campylobacter fetus subsp. Venerealis, Neospora caninum, Mycobacterium bovis, Escherichia coli y Borrelia burgdorferi). El límite de detección (LoD) de las PCRs fue determinado usando diluciones seriadas de L. interrogans serogrupo Pomona serovar Pomona Pomona. La secuencia de lipl32 fue detectada en el 100% de las cepas de leptospiras patógenas e intermedia utilizada (19/19). Las secuencias ligBct y ligBpet fueron detectadas en el 90% de las cepas patógenas (17/19), sin detección en el grupo no patógeno e intermedio. No hubo detección de ADN genómico en las especies diferentes a leptospira utilizadas, remarcando la especificidad de las PCR utilizadas en la comparación. El LoD fue 1*103 leptospiras/mL para las tres PCRs. Estos resultados refuerzan la propuesta de utilizar al gen ligB para detectar el ADN de leptospiras patógenas, en comparación con la PCR que detecta el gen lipL32 en leptospiras intermedias. Por otro lado, los genes ligBct y ligBpet no fueron detectados en L. weilii serogrupo Sarmin serovar Sarmin Sarmin y L. santarosai serogrupo Sejroe serovar Guaricura M4/98. Nuestros resultados muestran que los tres ensayos de PCR son sólidos, específicos y útiles para detectar ADN de leptospiras patógenas, y que las tres PCRs son robustas, específicas y pueden ser usadas para la detección de la leptospirosis. Por otro lado, estos son los primeros resultados informados que sugieren la ausencia de la secuencia diana de ligB en estos dos serovares. La validación sigue siendo un tema pendiente con respecto al diagnóstico de la leptospirosis animal, y cada laboratorio individual es responsable de la validación del ensayo particular utilizado para el tejido, el líquido y las especies que se analizan.