Ensayo animal utilizando Mesocricetus auratus para el estudio de técnicas diagnósticas moleculares para leptospirosis

OLIVIA WATANABE; CRISTINA SANCHEZ; GRUNE LOFFLER, SYLVIA; HAMER, MICAELA; ORTEGA, FACUNDO; MARA MARTINEZ; SARAULLO, VANINA; ESTEBAN, MICAELA; BIBIANA BRIHUEGA

Jornada; XXII Jornadas de divulgación técnico-científicas.; 2022

Universidad Nacional de Rosario

La leptospirosis animal representa un gran riesgo no sólo a nivel de salud pública debido a que es una zoonosis, sino también porque causa grandes pérdidas económicas en la producción agropecuaria. Esta enfermedad causa abortos y muerte perinatal en los animales como bovinos, porcinos, ovinos y equinos; pero también se asocia a manifestaciones gastrointestinales, enfermedad renal y muerte en caninos. Todos ellos pueden actuar como fuentes de infección para el humano. Es por ello que es de suma importancia contar con herramientas de diagnóstico que sean accesibles y sencillas de realizar, con alta sensibilidad y especificidad, como lo es la técnica de amplificación de isotérmica mediada por Loops (LAMP)1. En este estudio se realizó un ensayo animal para evaluar el rendimiento de Lepto-LAMP y de PCR LipL32 frente a muestras clínicas. Lepto-LAMP utiliza tres pares de primers cuya secuencia blanco es la región 16S ARNr de leptospiras patógenas 2 y calceína como indicador colorimétrico para la observación de resultados: naranja, sin fluorescencia bajo irradiación UV en resultados negativos y amarillo, con fluorescencia en positivos. PCR LipL32 permite amplificar un fragmento de 423 pb del gen que codifica para la proteína de membrana LipL32 de leptospiras patógenas3. Para la evaluación de la sensibilidad analítica de ambas técnicas se utilizaron diluciones seriadas de ADN de L. interrogans serovar Pomona cepa Pomona extraído con resina Chelex-1004 en agua de manera que en el tubo de reacción contenía entre 103 y 10-2 pg de ADN. Como control de contaminación sin templado se utilizó agua libre de nucleasas. Para evaluar el rendimiento de ambas técnicas moleculares en muestras animales, se utilizó un total de tres hámsters sirios dorados (Mesocricetus auratus) para obtener muestras de animales y así comparar ambas técnicas Lepto-LAMP y PCR LipL32. Este ensayo siguió el protocolo recomendado por Haake5. Se inoculó 1 mL de cultivo de L. interrogans serovar Pomona cepa Pomona altamente virulenta en medio EMJH (108 leptospiras/mL) por vía intraperitoneal en dos hámsters (llamados Po-1 y Po-2), mientras que otro hámster fue inoculado con 1mL de solución salina como control (llamado CN-1). Tras siete días después de la inoculación, todos los hámsters fueron anestesiados con isoflurano para recoger sangre y, posteriormente, se les practicó la eutanasia por dislocación cervical. Se tomaron muestras de riñón, pulmones, bazo e hígado. Se realizó la extracción de ADN a partir de suero, sangre y órganos con resina Chelex-1004 y se utilizó para el ensayo LAMP y PCR. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales Experimentales (CICUAE) como procedimiento operativo estandarizado #48/18. El límite de detección de Lepto-LAMP alcanzó 1 pg de ADN leptospiral por reacción. Por otro lado, PCR LipL32 mostró amplificación hasta 10 pg de ADN por reacción. Los hámsters infectados, tanto Po-1 como Po-2, mostraron reacción LAMP positiva en todas las muestras, observadas a simple vista o bajo radiación UV. En el caso del ADN obtenido de la muestra del coágulo, mostró un color rojo oscuro a simple vista que podría llevar a un resultado dudoso ya que no es ni naranja ni amarillo, sin embargo, este problema se resolvió irradiando con luz UV y observando la fluorescencia. Con PCR LipL32, las muestras que resultaron positivas fueron riñón, bazo, hígado y pulmón para ambos animales y el suero de Po-1. El suero de Po-2 y el coágulo de Po-1 y Po-2 no presentaron amplificación. Finalmente, no hubo amplificación en ningún caso de las muestras del hámster no infectado CN-1 utilizando LAMP o PCR. Los resultados negativos de la PCR en muestras de suero o coágulo, pero positivos por LAMP podrían explicarse por la diferencia entre los límites de detección de ambas técnicas. Se debe tener en cuenta que la infección por leptospirosis es bifásica. Esto significa que, en la fase aguda, las leptospiras se encontrarán en la sangre, pero más tarde invadirán órganos como el hígado, el bazo, los pulmones y el riñón. Por lo tanto, es más probable encontrar ADN leptospiral en los órganos u orina en la etapa más tardía de la infección que en suero o sangre. La mayor sensibilidad analítica de Lepto-LAMP permitiría detectar más muestras positivas en animales infectados en comparación con la PCR LipL32. Además, es sabido que las polimerasas isotérmicas son más resistentes a los inhibidores presentes en el ADN extraído, como la hemoglobina, que las enzimas de PCR convencional. Lepto-LAMP ha probado ser eficaz para su utilización en la detección de ADN leptospiral en muestras clínicas animales, siendo más sensible que la PCR LipL32 utilizada como técnica de referencia. De esta manera, sería de gran utilidad como técnica de tamizaje para una detección de Leptospira spp. en diferentes muestras y tejidos en forma rápida y sencilla.