Transformación genética del genotipo recalcitrante C. limon cv. Eureka para incrementar la defensa contra Xanthomonas citri subsp. Citri.

LEDESMA, ANDREA VERÓNICA; ROMERO, AÍDA LORENA; CASTELLANO RENGEL, MICAELA SOFÍA; NOGUERA, ALDO SERGIO; ENRIQUE, RAMON ATANASIO; FILIPPONE, MARÍA PAULA; SENDÍN, LORENA NOELIA

San Carlos de Bariloche

Simposio; I Simposio de Ciencias Agrarias de INTA; 2022

Los genotipos recalcitrantes son aquellos en los que resulta difícil la regeneración in vitro de embriones somáticos y/o de brotes adventicios, lo cual dificulta la aplicación de diferentes estrategias biotecnológicas de mejoramiento como la transgénesis, edición de genoma, multiplicación in vitro, etc. El cultivar Eureka de Citrus limon, uno de los genotipos más importantes para la citricultura del NOA, es recalcitrante al cultivo de tejidos. Por esta razón, el grupo Citrus de la Sección Biotecnología de la EEAOC, trabaja desde hace años en el estudio de diversos factores implicados en la recalcitrancia. En este sentido, se demostró que la concentración interna de las hormonas auxinas en el cv. Eureka es superior respecto a los genotipos cítricos no-recalcitrantes. A partir de esto se evaluó el efecto producido en la regeneración de C. limon al eliminar las hormonas en la etapa de inducción de callo observando un incremento significativo de la regeneración. En base a lo expuesto, el objetivo de este trabajo fue aplicar el protocolo ajustado de regeneración para C. limon con el fin de incorporar genes que otorguen características de interés agronómico al cultivo mediante transformación genética mediada por Agrobacterium tumefaciens (At). Para ello, se utilizó una construcción génica generada en nuestro laboratorio, que lleva el gen de resistencia Bs2 de pimiento el cual demostró disminuir los síntomas de la cancrosis (agente causal: Xanthomonas citri subsp. citri, Xcc) cuando fue expresado en Citrus sinensis. Esta construcción lleva el gen de selección nptII que otorga resistencia a kanamicina y el gen reportero gus que confiere coloración azul al tejido transformado, tras una tinción histoquímica. Se llevaron a cabo experimentos de transformación utilizando segmentos internodales de epicótilo de plántulas de 6 semanas germinadas in vitro los cuales fueron inoculados por inmersión en una suspensión de At portadora del gen Bs2. Los explantos se colocaron durante dos días en medio de co-cultivo sin hormonas (Sales MS, Sacarosa 3% y vitaminas) y posteriormente se transfirieron al medio de selección (Sales MS, Sacarosa 3% y vitaminas) adicionado con 3 mg/L de Bencilaminopurina (BAP) y 50 mg/L de Kanamicina. A los 60 días, los brotes regenerados fueron evaluados histoquimicamente por su actividad GUS; solo fueron considerados positivos aquellos brotes que mostraron coloración azul uniforme. Se realizaron tres experimentos con una eficiencia de transformación promedio de 1,35%. La obtención de una planta transgénica de limonero constituye un hito de importancia a nivel nacional y regional, dada la característica recalcitrante para el cultivo in vitro de este genotipo cítrico, constituyéndose como la primera planta transgénica de C. limon cv. Eureka con un gen de resistencia a enfermedades.