Nuevas estrategias para el desarrollo de ligandos peptídicos por medio de bibliotecas combinatorias

MARANI MARIELA M.; MARTÍNEZ CERON MARÍA C.; GIUDICESSI SILVANA L.; OLIVEIRA ELIANDRE; CÔTÉ SIMON; ERRA-BALSELLS ROSA; ALBERICIO FERNANDO; CASCONE OSVALDO; CAMPERI SILVIA A.

Mar del Plata, Buenos Aires, ARGENTINA

Simposio; XVI SINAQO. XVI Simposio Nacional de Química Orgánica.; 2007

SAIQO (Sociedad Argentina de Investigaciones en Química Orgánica)

La industria biotecnológica ha introducido las proteínas terapéuticas en el mercado farmacéutico. Sin embargo, sus elevados precios restringen su uso masivo. El 50-80% del costo total de su producción es debido a su purificación. La cromatografía de afinidad (AC) es considerada el método más eficiente para el aislamiento y purificación de proteínas en mezclas complejas. Muchos procesos convencionales usan AC con anticuerpos monoclonales (mAbs) como ligandos por su alta afinidad y especificidad sin embargo, su alto costo dificulta su uso a escala industrial. Los péptidos cortos como ligandos en AC son ideales para la purificación de biofármacos por su fácil síntesis, estabilidad, selectividad y afinidad. La síntesis de bibliotecas combinatorias peptídicas permite obtener millones de péptidos, facilitando el descubrimiento de ligandos adecuados. Dentro de las diferentes estrategias de construcción de bibliotecas peptídicas en fase sólida, el método dividir-acoplar-recombinar (DAR) es el más conveniente. Éste se basa en (i) dividir el soporte sólido en porciones iguales equivalentes al número de aminoácidos que se utilizarán en la construcción de la biblioteca, (ii) acoplar en cada porción un aminoácido diferente y (iii) mezclar las porciones. Esto asegura que todos los representantes de la biblioteca estén en igual proporción en la forma de una “una bolilla-un péptido” (en cada bolilla de resina habrá una única entidad peptídica). Desarrollamos una nueva estrategia de síntesis de bibliotecas combinatorias peptídicas que permite la fácil identificación de ligandos peptídicos para cualquier proteína de interés. Sobre la resina ChemMatrixR se inmovilizó ácido hidroximetilbenzóico (HMBA) y 5 residuos de Gly. Sobre esta estructura se construyó por la química 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc) una biblioteca combinatoria peptídica del tipo “una bolilla-un péptido” de la forma XXXXGly5 siendo X= todos los aminoácidos naturales. Los grupos protectores de las cadenas laterales se eliminaron por tratamiento con TFA. Se realizó el screening  de la biblioteca usando como proteína modelo estreptavidina (SA) marcada con ATTO-590 (colorante con fluorescencia roja). Se aislaron las bolillas fluorescentes y se desorbió la SA lavando con guanidina-HCl y H2O. Las bolillas lavadas se colocaron en la placa del espectrómetro de masa MALDI TOF-TOF y se liberaron los péptidos con vapor de amoníaco. Para la elusión de los péptidos se utilizó AcH/ACN/H2O. Se secuenciaron los péptidos por MALDI TOF-TOF utilizando como matriz ácido a-ciano-4-hidroxicinámico (CHCA). Las propiedades anfifílicas de la resina ChemMatrixR permitieron tanto la síntesis en solventes orgánicos como el screening en medio acuoso. El éster bencílico que forma el HMBA con el primer aminoácido, es estable a piperidina y TFA, con lo cual se pudo alongar el péptido por la química Fmoc y remover los grupos protectores de las cadenas laterales con TFA sin liberar el péptido de la resina. Del screening con SA-ATTO-590 se aislaron 40 bolillas con fluorescencia. La estabilidad de la resina ChemMatrixR a condiciones nucleofílicas permitió la liberación del péptido de la bolilla de resina con vapor de amoníaco. El clivaje no deó contaminantes, facilitando la posterior secuenciación del péptido. De las 40 secuencias obtenidas, la mayoría contuvo los aminoácidos Phe, Tyr, Leu e his, y la secuencia más repetida fue Leu-Leu-His-Tyr, que a su vez mostró alta afinidad por ATTO.