Participación de ferredoxina NADP(H) reductasa en la reactivación de hidroliasas en Escherichia coli.

GIRÓ MARIANA; CARRILLO NÉSTOR; KRAPP ADRIANA

Rosario, Santa Fe

Congreso; VII Congreso - XXV Reunión anual de la sociedad de Biología de Rosario; 2005

Sociedad de Biología de Rosario

Ferredoxina-NADP(H) reductasa (FPR) y glucosa 6-P deshidrogenasa (G6PD)son dos enzimas reclutadas por el regulón soxRS durante la respuesta al superóxido (O2•-) en Escherichia coli. Uno de los principales blancos de la toxicidad del O2•- es la familia de hidroliasas que poseen un grupo [4Fe-4S] expuesto al solvente, que incluyen la fumarasa A, aconitasa B, hidroxiacido dehidratasa y 6-fosfogluconato dehidratasa, pertenecientes a distintas vías metabólicas. La susceptibilidad al O2•- proviene de la habilidad del mismo para oxidar el Fe, e inactivar la correspondiente enzima. La reconstitución de estos centros requiere la reducción e incorporación del Fe, llevándose a cabo en pocos minutos una vez que finalizó el estrés oxidativo. G6PD es la principal productora de NADPH y su función durante el estrés oxidativo sería la restitución y provisión de los niveles de NADPH para las vías de reparación. FPR provee durante el crecimiento normal ferredoxina (Fd) y flavodoxina (Fld) reducidas para una variedad de vías metabólicas que requieren transportadores de bajo potencial; sin imbargo no se ha dilucidado la contribución de esta enzima durante el estrés oxidativo. Para investigar si FPR participa en la reconstitución de los centros [4Fe-4S] de dos enzimas: aconitasa B y 6 fosfogluconato dehidratasa, se diseñó un sistema in vitro en donde las enzimas presentes en extractos de E. coli se inactivaron y se siguió la activación subsecuente en presencia de FPR, G6PD, Fd o Fld, NADP+ y cisteína. Al cabo de 20 minutos de incubación se observó la recuperación de las dos actividades, mientras que en los controles en donde faltaba algún componente no se obtuvo la reconstitución de las actividades enzimáticas. También se trabajó con células de E. coli expresando distintos niveles de FPR, que fueron expuestas a un agente generador de superóxido (metil viológeno) y luego se evaluó la reactivación de las enzimas. La cepa salvaje y la mutante nula (fpr -) presentaron velocidades de reactivación similares, sin embargo la sobreexpresión de FPR aceleró dramáticamente la reactivación de ambas dehidratasas. Estos resultados, junto a la cinética de inducción, sugieren que FPR y G6PD actúan concertadamente durante la respuesta SoxRS para entregar equivalentes de reducción de los carbohidratos, vía NADP(H), a los sustratos de FPR (Fd y Fld) participando en la reconstitución de centros Fe-S dañados por O2•- .