Desarrollo de un ELISA diferencial basado en la expresión en baculovirus del mayor dominio inmunogénico de la glicoproteína E del virus de la EA

SERENA M. S; METZ G; CORVA S; MORTOLA E; ECHEVERRIA M. G

Anales de la Academia Nacional de Agronomía y Veterinaria

ACADEMIA NACIONAL DE AGRONOMÍA Y VETERINARIA

Año: 2009 p. 297 - 316

0327-8093

Uno de los objetivos principales de este trabajo fue poder producir una proteína viral recombinante de alto valor antigénico, para la aplicación en el diagnóstico serológico de la EA. Para tal fin y en relación a la utilización de vacunas gE negativas combinadas con el uso de pruebas de ELISA diferenciales, como lo establece la Legislación del SENASA, es que se seleccionό una cepa autóctona de SuHV1. El gen completo que codifica para la glicoproteína gE de la cepa CL15 fue secuenciado y analizado con las cepas de referencia de SuVH1 disponibles en el GenBank. La secuencia nucleotídica y aminoacídica de la cepa CL15 fue analizada con las secuencias de las cepas de referencia disponibles en la base de datos del GenBank. De su análisis concluímos que el porcentaje de identidad entre ellas fue de 95-99%, lo que indica que la cepa seleccionada, no presenta variaciones ni modificaciones relevantes con respecto a las otras cepas distribuídas en todo el mundo. En este trabajo se logró aislar el fragmento que codifica para el dominio más inmunogénico de gE, el cual fue expresado en baculovirus utilizando un sistema presentador de antígenos que contiene el gen M6 que codifica para la proteína no estructural NS1 del virus de la Lengua Azul, que posee la habilidad de formar estructuras tubulares estables altamente inmunogénicas en el interior de las células infectadas por el virus. Estos túbulos operan como presentadores de antígenos desencadenando una importante respuesta inmune. La capacidad de esta proteína como presentadora de antígenos, fue la base para el desarrollo de vectores de expresión para baculovirus y la utilizan para la expresión de péptidos recombinantes en células de insecto, de numerosos agentes virales. El nivel de expresión logrado utilizando este sistema, fue óptimo y cuando la proteína recombinante NS1/EpitgE fue enfrentada en la técnica de IB con anticuerpos policlonales porcinos y un suero policlonal de cobayo anti-NS1, reaccionó específicamente, demostrando su capacidad antigénica de reconocer anticuerpos específicos. Las imágenes obtenidas tras la observación de células infectadas con el baculovirus recombinante, luego de llevarse a cabo la técnica de IFI, revelό la presencia de estructuras características positivas. A su vez, la microscopía electrónica arrojό imágenes de aquellas estructuras tubulares, longitudinales y esféricas, correspondientes a los túbulos constituyentes de la proteína NS1. Se obtuvo una buena concentración de la proteína purificada en gradiente por ultracentrifugación y así se utilizó como antígeno para el desarrollo de la prueba de ELISA diferencial. Se analizó y verificό la capacidad del antígeno (proteína recombinante NS1/EpitgE) de reaccionar con los diferentes sueros positivos y negativos a SuHV1. Los índices de sensibilidad, especificidad y VPP con la prueba de VN obtenidos muestran que la eficacia de ambas pruebas son comparables. Esto permite que el ELISA desarrollado en este trabajo, al tener una especificidad similar a la prueba estándar (VN) sea de aplicación masiva en laboratorios que no posean una infraestructura sofisticada.  El éxito de un programa de erradicación para la EA depende fundamentalmente del uso de pruebas serológicas diferenciales suficientemente sensibles y específicos que permiten discriminar animales naturalmente infectados de vacunados. La sensibilidad de estas pruebas podría ser evaluada de distintas maneras, incluyendo la habilidad de detectar una inmunidad humoral temprana a la infección, la capacidad de detectar latencia de cerdos infectados o bien la capacidad de detectar bajos niveles de anticuerpos en cualquier etapa de la infección. En el presente trabajo fue posible obtener un antígeno, a partir de células de insecto infectadas con baculovirus recombinante, el cual permitirá el desarrollo de una prueba diagnόstica de fabricación propia, capaz de diferenciar animales vacunados de infectados por el virus SuHV1. Los resultados obtenidos utilizando la proteína NS1/EpitgE como antígeno para una prueba diagnόstica de ELISA, son muy alentadores y abren el camino para una futura validación de esta prueba, con la finalidad de optimizar el control y erradicación de esta enfermedad de especial importancia dado el marcado incremento de la cría de cerdos en nuestro país y las actuales características de comercialización. De esto concluímos que el sistema de expresión seleccionado y la estrategia diseñada nos permite, de acuerdo a los resultados,  utilizar la proteína recombinante NS1/EpitgE como una proteína antigénica específica y a futuro, planificar inmunógenos responsables de generar respuesta inmune. En conclusión, los resultados obtenidos revelan la capacidad inmunogénica de nuestra proteína recombinante que incluye el dominio más inmunogénico de la gE del SuHV1, al ser reconocida tanto por anticuerpos monoclonales contra gE, como por sueros policlonales de animales infectados. Este atributo, hace a este antígeno recombinante muy atractivo particularmente para utilizar en pruebas diagnósticas para ser usadas como herramientas en estudios epidemiológicos de la enfermedad.