Acumulación y tolerancia al metal pesado cadmio en rizobios de vida libre y en simbiosis con leguminosas

STELLA CASTRO, ELIANA BIANUCCI, JÉSICA RIVADENEIRA, MARÍA DEL CARMEN TORDABLE, ADRIANA FABRA, JUAN SOBRINO-PLATA, LUIS HERNÁNDEZ, RAMÓN CARPENA-RUIZ

Buenos Aires

Taller; Taller internacional sobre rizosfera, biodiversidad y agricultura sustentanble (TIRBAS); 2010

Los metales pesados están presentes naturalmente en los suelos, pero en los últimos años la polución ambiental por metales es cada vez más extensiva como consecuencia del aumento de una variedad de actividades antropogénicas que afectan progresivamente a los diferentes ecosistemas. Uno de los metales pesados más perjudiciales para la naturaleza, aún a bajas concentraciones es el cadmio (Cd). En suelos agrícolas, las principales fuentes de Cd provienen del uso de fertilizantes a base de fosfatos, lodos y residuos industriales. En particular, el aporte de Cd por los fertilizantes fosfatados es considerado uno de los problemas más graves de contaminación en países que tienen una intensa economía de exportación agrícola. La toxicidad por metales pesados se debe en parte al estrés oxidativo producido por las especies reactivas del oxígeno (EROs) generadas a través de diferentes mecanismos dependiendo del metal de que se trate. El Cd no experimenta cambios redox y por lo tanto, a diferencia del Fe o Cu, no actúa directamente en la generación de EROs. Sin embargo, puede actuar como prooxidante a través de la alteración de los sistemas de defensa antioxidante. El estrés oxidativo producido por el Cd se manifiesta por daños a lípidos y proteínas tales como la peroxidación lipídica y la formación de grupos carbonilo. Los microorganismos y las plantas poseen sistemas de defensa antioxidante (enzimático y no enzimático) para mantener el estado redox y mitigar el daño causado por el estrés oxidativo. El sistema de defensa antioxidante enzimático incluye varias enzimas, las cuales son capaces de remover las EROs entre ellas superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT), involucradas en la detoxificación del anión superóxido (O2.-) y del peróxido de hidrógeno (H2O2), respectivamente. La molécula de glutatión (GSH), tripéptido formado por Glu-Cys-Gly, es uno de los ejemplos mejores conocidos del sistema de defensa antioxidante no enzimático con actividad secuestrante de EROs para producir glutatión oxidado (GSSG). Las enzimas relacionadas con el metabolismo del GSH también juegan un rol crucial en la defensa antioxidante. La enzima GSH peroxidasa (GPX) cataliza la reducción de hidroperóxidos orgánicos y peróxidos de lípidos, usando al GSH como donador de electrones. La enzima GSH reductasa (GR) es responsable de la reducción del GSSG a dos moléculas GSH y  su actividad resulta fundamental para mantener una elevada relación GSH/GSSG, controlando el estado redox de la célula. Por otra parte, las plantas han desarrollado distintas estrategias para protegerse de la toxicidad del Cd que involucran a la raíz como primera barrera de defensa mediante la inmovilización del metal y el secuestro del Cd intracelular por fitoquelatinas (PCs) y la posterior compartimentalización en la vacuola. Las PCs son polipéptidos de composición (γGlu-Cys)n-Gly, donde n=2-11, y  su síntesis se induce en presencia del metal usando al GSH como sustrato. El comportamiento de los rizobios y las leguminosas frente al Cd manifiesta diferencias entre las especies en lo que concierne a la acumulación de este metal como a sus efectos tóxicos, estas diferencias están usualmente asociadas a la tolerancia al metal. El maní (Arachis hypogaea L.) es una leguminosa de alto valor agronómico en Argentina y el 92% de su producción se obtiene en la zona central de la provincia de Córdoba donde se concentra el cultivo, comercialización, selección del maní de confitería e industrialización. Sin bien existen estudios del efecto del Cd sobre el crecimiento y la nodulación de leguminosas tales como soja y lupino, entre otras, no hay información disponible sobre el efecto que este metal pueda ocasionar sobre los rizobios en vida libre y en simbiosis con las plantas de maní. Nuestro grupo de investigación se enfocó a estudiar el efecto del Cd sobre el crecimiento y la viabilidad de las cepas de Bradyrhizobium sp. que nodulan maní en presencia de distintas concentraciones de Cd. Para ello, se utilizaron cepas de bradyrizobios de referencia y nativas aisladas de los suelos maniseros de Córdoba. La cepa de referencia Bradyrhizobium sp. SEMIA6144 fue capaz de crecer  hasta 10 µM Cd mientras que la mutante defectiva en GSH, Bradyrhizobium sp. SEMIA6144-S7Z, no creció a esa concentración. Las cepas nativas Bradyrhizobium sp. NOD31 y Bradyrhizobium sp. NLH25 crecieron hasta 30 µM Cd. Sobre la base de estos resultados, las cepas se clasificaron como sensibles y tolerantes capaces de crecer hasta 10 y 30 µM Cd, respectivamente. Durante el crecimiento bacteriano, las cepas de Bradyrhizobium sp. mostraron diferencias en la acumulación de Cd, siendo Bradyrhizobium sp. SEMIA6144 la que mayor concentración de Cd acumuló. La distribución de Cd en los distintos compartimientos celulares no mostró diferencias entre la cepa sensible (Bradyrhizobium sp. SEMIA6144) y tolerante (Bradyrhizobium sp. NLH25), por lo que es posible inferir que la acumulación del metal en la pared celular no sería una de las estrategias involucradas en la tolerancia al efecto tóxico de este metal. Los estudios de microscopía electrónica mostraron que el Cd indujo cambios en la morfología celular y la ultraestructura de los diferentes compartimientos correspondientes al citoplasma y la pared celular de ambas cepas sensible y tolerante al metal. Las cepas de bradyrizobios sensibles y tolerantes presentaron un incremento de la peroxidación lipídica a 10 ó 30 µM Cd, respectivamente. Bajo estas condiciones de estrés oxidativo, sólo se observó un alto contenido de GSH en las cepas tolerantes infiriendo que este tiol estaría involucrado en la defensa antioxidante favoreciendo así el crecimiento bacteriano. Por su parte, una mayor actividad de las enzimas antioxidantes GR y GPX en Bradyrhizobium sp. NLH25 permitió mantener una elevada relación GSH/GSSG intracelular, siendo ésta una de las posibles causas de la tolerancia al metal. Esta respuesta diferencial de los bradyrizobios al Cd indicaría que, aún cuando estas cepas poseen la misma maquinaria metabólica, existen variaciones específicas de cepa que influyen en la tolerancia al metal. Así, la tolerancia observada en las cepas nativas permite suponer que estarían mejor adaptadas a crecer a altas concentraciones de Cd alcanzando una mayor actividad metabólica y consecuentemente mayor viabilidad. Las plantas de maní mostraron alteraciones en el crecimiento dependiendo de la concentración de Cd aplicada al medio de cultivo. A 10 µM Cd, las raíces de las plantas fueron capaces de sintetizar diferentes tipos de fitoquelatinas (PC2, PC3 y PC4). En base a estos resultados, es posible asumir que si bien el Cd afectó el crecimiento de la planta, la producción de PCs evitó un daño extensivo del metal sobre los componentes celulares como lípidos y proteínas en hojas y raíces. Es así que las PCs podrían cumplir un rol importante en el mecanismo de defensa de la planta secuestrando el Cd intracelular y posiblemente limitar el daño oxidativo a macromoléculas. En la asociación simbiótica Bradyrhizobium sp.-maní, la adición de 10 µM Cd al medio de cultivo  produjo una disminución significativa del número y peso seco de nódulos en las plantas inoculadas con la cepa sensible (Bradyrhizobium sp. SEMIA6144) ó con la cepa tolerante (Bradyrhizobium sp. NLH25). Si bien la estructura anatómica de los nódulos fue similar en las plantas controles y en las tratadas con Cd, en los nódulos de estas últimas se observaron modificaciones histológicas en las células más superficiales de la corteza. El agregado de Cd, produjo una disminución significativa del tamaño de las zonas de infección en ambas cepas, siendo en los nódulos de la cepa sensible donde se observó además, una mayor cantidad de células sin infectar. Estos resultados ponen en evidencia que el Cd impacta negativamente en el proceso de nodulación de las plantas de maní independientemente de la tolerancia al metal que presenten las cepas de bradyrizobios usadas como inoculantes.