Optimizacion de la produccion de quimosina bovina recombinante en la levadura metilotrófica Pichia pastoris

NOSEDA DIEGO GABRIEL; RECUPERO MATIAS; BLASCO MARTIN; GALVAGNO MIGUEL

Santiago

Jornada; Jornadas Internacionales de Biotecnologia de Levaduras; 2013

Universidad de Santiago de Chile

La quimosina bovina es una aspartil proteasa sintetizada en el cuarto estómago (abomazo) de los terneros neonatos. Esta enzima es secretada como un zimógeno que en condiciones ácidas es convertida a su forma activa mediante degradación autocatalítica. La quimosina cataliza el clivado selectivo de una unión peptídica presente en las Kappa caseinas que estabilizan las micelas de la leche, provocando de esta manera su coagulación. Asimismo, la quimosina presenta una baja actividad proteolítica inespecífica. Dichas características hacen que esta enzima sea empleada en la elaboración de quesos. La quimosina bovina ha sido expresada de modo recombinante en diversos microorganismos siendo utilizada mundialmente en la industria quesera. El sistema de expresión de la levadura metilotrófica Pichia pastoris posee diversas ventajas frente a otros sistemas como ser alta densidades celulares en procesos fermentativos y elevado nivel de expresión de proteínas heterólogas. Presenta además una eficiente secreción de proteínas recombinantes extracelulares con modificaciones post-traduccionales y reducida secreción de proteínas nativas. En P. pastoris el sistema inducible de control de la expresión más usado es el promotor del gen de la enzima alcohol oxidasa I (AOX1), el cual es fuertemente inducido por metanol como única fuente de carbono. En trabajos anteriores hemos analizado el efecto del pH, temperatura y agregado de sorbitol y ácido ascórbico, sobre el crecimiento de P. pastoris y producción de quimosina recombinante; y hemos realizado el escalado del bioproceso mediante estrategias de fermentación fed-batch en biorreactor. En este trabajo se determinó la cantidad óptima de biomasa al inicio de la etapa de inducción con metanol para la obtención de una mayor producción de quimosina bovina recombinante, utilizando cultivos batch en erlenmeyers. Luego se llevó a cabo la determinación de la velocidad específica de crecimiento (μ) óptima para conseguir una mayor productividad de quimosina bovina recombinante durante la etapa de cultivo fed-batch con metanol en fermentador. De este modo se logró establecer que un elevado nivel de biomasa al inicio de la etapa de inducción con metanol permite obtener una mayor producción de quimosina recombinante. Asimismo, se determinó que empleando una baja velocidad específica de crecimiento (μ~0,01) durante la etapa fed-batch con metanol en biorreactor se consigue producir mayor cantidad de quimosina. Por último, utilizando ultrafiltración y cromatografía líquida (FPLC) con tamiz molecular se realizó la purificación de la enzima recombinante del resto de las proteínas secretadas por P. pastoris. En conclusión, se consiguió avanzar con el proceso de optimización de la producción de quimosina bovina recombinante en la levadura P. pastoris como así también con el procedimiento de purificación.