PERSONAL DE APOYO
NEME TAUIL Ricardo Martin
convenios, asesorías y/o servicios tecnológicos
Título:
EP- Estudios de biosimilaridad de proteína recombinante de 19 kDa
Autor/es:
MORENO DE COLONNA, SILVIA; VALACCO, MARÍA PÍA; COUTO, ALICIA; NEME TAUIL, RICARDO MARTÍN; FERNÁNDEZ, JORGE GERMÁN; PAROLA, ALEJANDRO
Fecha inicio:
2017-01-01
Fecha finalización:
2017-12-01
Campo de Aplicación:
Tecnologia sanitaria y curativa-Varios
Descripción:
La empresa interesada en el servicio nos provee con aproximadamente un miligramo de cada lote del producto biosimilar que se desea validar, y del producto innovador.Se realizan varios estudios de caracterización de la proteína en cuanto a su masa molecular y secuencia aminoacídica, Para la determinación de masa molecular de la intacta se utilizó el espectrómetro de Masa MALDI TOF TOF (Bruker), y actualmente se está repitiendo la determinación por HPLC, acoplado a MSMS con tecnología Orbitrap (Q Exactive), Para el mapeo peptídico, que pretende cubrir la mayor parte de la secuencia por MS y MSMS, se comenzó realizando digestiones virtuales para determinar enzima óptima para obtener la mayor cobertura posible, usando enzimas que permitan detectar zonas complementarias de la secuencia, y para asegurarnos de cubrir extremos N y C terminales. A partir de este análisis se decidió realizar digestiones enzimáticas de la molécula con varias proteasas de sitio de corte específico.(Tripsina, corta a la derecha de lisinas y argininas; Quimotripsina, corta a la derecha de triptofano, metionina, fenilalanina, tirosina, leucina; Gluc-c, corta a la derecha de glutámico y aspártico) y análisis de los fragmentos proteolíticos por MS y MSMS por MALDI TOF y con nanoHPLC, acoplada a Q Exactive para lograr cobertura total de la secuencia con los péptidos identificados.Se logró una cobertura de aproximadamente un 96%.Se decidió agregar la digestión con la enzima Asp-N, que corta a la izquierda de Asparaginas, que tal como esperábamos permitió lograr el 100% de cobertura. Se elaboraron los informes según requisitos de las empresas, para ser presentados ante entidades regulatorias.Para los estudios de glicosilación se realizaron digestiones con las mismas enzimas pero luego se realizó un enriquecimiento en glicopéptidos con una micro columna HILIC para poder verificar sitios de glicosilación y glicanos presentes.
