Producción de antraquinonas en raíces transformadas de Rubia tinctorum en un biorreactor de tanque agitado modificado

PERASSOLO, MARÍA; CARDILLO, ALEJANDRA BEATRIZ; GIULIETTI, ANA MARÍA; RODRÍGUEZ TALOU, JULIÁN

Santa Fe

Simposio; 3º simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2014

Introducción Las antraquinonas (AQs) son metabolitos secundarios que, además de haber sido utilizados tradicionalmente como colorantes en la industria, presentan numerosas aplicaciones terapéuticas. Entre ellas, cabe mencionar su actividad antitumoral y para el tratamiento de la Hepatitis C. Actualmente, son producidas principalmente por síntesis química, aunque hay una tendencia hacia una ?química verde?, sustentable, que promueve el desarrollo de procesos que minimicen el uso y generación de sustancias peligrosas, disminuyendo así los efectos adversos sobre el medio ambiente. Por este motivo, una alternativa para su obtención es el cultivo in vitro de especies vegetales productoras, como por ejemplo el cultivo de raíces transformadas. Este tipo de cultivo, obtenido por infección del tejido vegetal con Agrobacterium rhizogenes, presenta una alta velocidad de crecimiento con independencia del agregado de reguladores de crecimiento, ausencia de geotropismo, alto grado de ramificación, y capacidad para producir metabolitos secundarios por largos períodos de tiempo. En este trabajo, se buscó optimizar la producción de AQs en cultivos de raíces transformadas de Rubia tinctorum mediante la selección del medio de cultivo y la elicitación, para finalmente escalar la producción en un biorreactor de tanque agitado. Metodología Las raíces fueron obtenidas por infección de explantos de R. tinctorum con A. rhizogenes LBA 9402. Fueron cultivadas en medio sólido y líquido, en condiciones controladas de temperatura (24±2°C), fotoperíodo (16h) y agitación (100 rpm). La transformación se confirmó por PCR. Curva de crecimiento y selección de medio de cultivo: Se ensayaron dos medios de cultivos diferentes: Lloyd & Mc Cown's Woody Plant Medium (WPM) y Gamborg B5, con la mitad de la concentración salina (B51/2), con el agregado de sacarosa (20 g/l). Se inocularon ~0,25 g de raíces en erlenmeyers de 100 ml con 25 ml de medio de cultivo. Se tomaron muestras a los 7, 14, 21, 28, 35 y 42 días, y se realizaron las siguientes determinaciones analíticas: biomasa (como peso fresco, PF), pH, conductividad, AQs (intra y extracelulares), sacarosa, fructosa y glucosa. Además se calculó el índice de crecimiento y parámetros cinéticos y estequiométricos de cada cultivo. Ensayos de elicitación: se realizaron en cultivos de raíces en medio B51/2 (~0,25 g de raíces con 25 ml del medio en erlenmeyers de 100 ml). Las raíces fueron cultivadas por 14 días en las condiciones habituales, y al cabo de este tiempo se elicitó con metil jasmonato (MeJ) 100 mM. Se tomaron muestras al momento de elicitar y a los 2, 4, y 7 días postelicitación (dpe). En todos los casos, se determinaron: biomasa, pH y AQs intra y extracelulares. Escalado: Se utilizó un biorreactor de tanque agitado (BIOFLO III, New Brunswick Scientific) adaptado para el cultivo de raíces (añadido de una malla plástica plegada en forma de zig-zag alrededor de los bafles). Se inocularon ~10 g de raíces cultivadas en WPM en 1,1 l de medio B51/2. La agitación se realizó para lograr una distribución uniforme de las raíces (150 rpm; 5 minutos). La aireación se mantuvo entre 0,2-0,3 vvm. A los 15 días de cultivo, las raíces fueron elicitadas con 100 µM de MeJ y fueron cosechadas a los 7 dpe. Se realizó la determinación de: pH, conductividad, sacarosa, glucosa y fructosa (en medio de cultivo), y de AQs (intra y extracelulares). En paralelo se llevó a cabo un ensayo en erlenmeyers. Resultados Selección del medio de cultivo: Las raíces cultivadas en WPM presentaron una mayor velocidad específica de crecimiento, lo que se tradujo en una mayor producción de biomasa (58,6% superior al cabo de 42 días), en comparación con el cultivo en B51/2. La producción de AQs (µmol/g PF) fue superior en B51/2 comparado con WPM a partir de los 14 días y hasta el final del ensayo (entre 20 y 100% superior), mientras que al evaluar la producción volumétrica (µmol/l), se obtuvieron niveles similares en ambos medios. El contenido intracelula rmáximo en WPM fue 6,7±0,9 µmol/g PF (28 días), y en B51/2 fue 12,0±1,8 µmol/g PF (42 días). En WPM, las AQs liberadas no superaron el 1% del total (35 días), mientras que en B51/2, llegó a un 10% a los 42 días. Dada la mayor liberación de AQs observada en B51/2, se eligió este medio para continuar con los ensayos de elicitación. Ensayos de elicitación: La elicitación con MeJ 100 µM no resultó en diferencias significativas en la producción de biomasa con respecto a los controles durante todo el período de tiempo estudiado. En presencia de MeJ, el contenido intracelular de AQs mostró incrementos del 50%, 73% y del 110% a los 2, 4 y 7 dpe, respectivamente. El contenido extracelular de AQs también se vio afectado por la elicitación, observándose una fracción soluble y otra insoluble: la fracción insoluble de AQs representó un 63, 56 y 38% del total de AQs liberadas a los 2, 4 y 7 dpe, respectivamente. Con respecto al total de AQs, la fracción liberada (solubles + insolubles) representa el 27, 23 y 17% a los 2, 4, y 7 dpe, respectivamente. Teniendo en cuenta todos esto, el tratamiento de las raíces transformadas con MeJ resultó en aumentos del 57, 110 y 127% en la producción total de AQs (AQs IC + AQs EC sol + AQs EC insol) a los 2,4 y 7 dpe, respectivamente. Escalado: El proceso llevado a cabo en el biorreactor de tanque agitado adaptado mostró resultados comparables a los obtenidos en los erlenmeyers, tanto en la biomasa final alcanzada (28,3 y 25,9 g PF/l, respectivamente), como al contenido intracelular de AQs al cabo de 7 días de elicitación con MeJ (24,4 y 27,0 µmol/g PF, respectivamente). La única diferencia observada fue en el contenido extracelular insoluble, que fue un 42% menor en el biorreactor, debido posiblemente a la adsorción de las AQs a la malla plástica, a los precintos empleados para sujetarla, y también a los componentes del biorreactor de acero inoxidable. Conclusiones: Se estableció un cultivo de raíces transformadas de R. tinctorum y se seleccionó un medio más adecuado para la obtención de AQs. Así, se observó que en medio B51/2, se logró una menor acumulación de biomasa pero una mayor capacidad de producción de AQs en comparación a lo obtenido en WPM, alcanzándose productividades volumétricas similares en ambos casos. El MeJ demostró ser un potente elicitor de la producción de AQs en raíces transformadas de R. tinctorum, alcanzándose una productividad volumétrica total de estos metabolitos secundarios entre 2,3 y 4,5 veces superior con respecto a los cultivos de raíces sin elicitar. Además, el MeJ ocasionó una intensa liberación de AQs al medio de cultivo, que llegó a representar el 50% del total de AQs producidas. Este hallazgo es sumamente interesante para la potencial purificación de estos metabolitos, ya que la extracción a partir del medio de cultivo sería más sencilla. Finalmente, se lograron combinar las estrategias de selección de medio de cultivo y elicitación para el escalado el cultivo de raíces de R. tinctorum. Se realizó el cultivo en un biorreactor de tanque agitado adaptado para el cultivo de estas raíces, obteniéndose rendimientos de producción de biomasa y AQs similares a los obtenidos en el cultivo en erlenmeyers. Con respecto a la recuperación de las AQs extracelulares solubles, debería evaluarse una estrategia alternativa de recuperación o un rediseño del biorreactor.