Caracterización funcional de los genes gp37 y chiA del granulovirus Epinotia aporema (EpapGV)

RICARDO SALVADOR; MARÍA LETICIA FERRELLI ; MARINA BIEDMA; ALICIA SCIOCCO-CAP; VÍCTOR ROMANOWSKI

Encuentro; XXIX Reunión Científica Anual de SAV; 2009

Sociedad Argentina de Virología

Una de las principales aplicaciones de los baculovirus es su uso como bioinsecticidas y, entre ellos, el nucleopoliedrovirus Anticarsia gemmatalis (AgMNPV) es el más ampliamente utilizado. En nuestro país, la plaga homónima se presenta atacando cultivos de leguminosas simultáneamente con Epinotia aporema, para la cual se ha desarrollado un bioinsecticida experimental a base de un granulovirus (E. aporema GV). Estudios previos mostraron que la administración conjunta de estos dos baculovirus produce una disminución en el tiempo letal de AgMNPV hacia larvas de A. gemmatalis. Una posible causa sería la presencia de ciertas proteínas contenidas en las preparaciones de cuerpos de oclusión de EpapGV que facilitarían la entrada de los viriones hacia el sitio inicial de la infección, las células del intestino medio. A partir del análisis de las secuencias genómicas disponibles de ambos virus, se iniciaron estudios tendientes a evaluar genes que codifican proteínas con posible efecto sobre la membrana peritrófica (mp) de las larvas, primera barrera que deben traspasar los viriones para alcanzar las células intestinales. En primer término se caracterizó el gen gp37 de EpapGV. En bacterias, existen genes homólogos a gp37 cuyos productos interactúan con quitinasas en el proceso de degradación de la quitina. En este trabajo se clonó y caracterizó el gen de la quitinasa (chiA) de EpapGV. Ambas proteínas (ausentes en AgMNPV) se expresaron en células de insecto (Hi5) utilizando AcMNPV como vector. También se obtuvieron AgMNPV recombinantes (rAgMNPV-gp37EpapGV y rAgMNPV-chiAEpapGV) para analizar su función in vivo. El análisis de la secuencia nucleotídica del gen chiA reveló que posee una longitud de 1713 nt y que se encuentra bajo la regulación de un promotor tardío. El mismo esta flanqueado por los ORFs v-cath e ie-1. La comparación con otras secuencias identificó a la chiA de Cydia pomonella granulovirus (CpGV) como la de mayor similitud nucleotídica (72%). El gen codifica para una proteína de 568 aminoácidos cuyo peso molecular fue estimado en 63 kDa. Se verificó la ausencia del motivo de retenciín en retículo (KDEL) y, mediante Western blot, la consecuente presencia de proteína en el sobrenadante. El análisis filogenético mostró una estrecha relación con las quitinasas bacterianas. CONCLUSION: La secuencia nucleotídica y aminoacídica de chiA de EpapGV, presenta las señales y motivos característicos de este grupo de enzimas. La pérdida del motivo proteico KDEL de retención en retículo endoplásmico, es una particularidad que comparte con la CHIA de CpGV. La expresión en células de insecto de CHIA permitió evaluar su actividad sobre quitina. Los recombinantes obtenidos y en especial los rAgMNPVs, constituyen valiosas herramientas para el estudio de la funcionalidad de los genes gp37 y chiA y para verificar si existe entre los productos de los mismos, la interacción descripta hasta el presente solo en bacterias.