PluriBAC: un sistema modular versátil basado en baculovirus para expresar múltiples genes heterólogos

AMOROS, LESLIE; MARCHESINI, ABRIL; SANTIAGO MANUEL GOMEZ BERGNA; GARCÍA FALLIT, MATÍAS; TONGIANI, SILVANA E.; VÁSQUEZ, LARISA; FERRELLI MARÍA LETICIA; VIDELA-RICHARDSON, GA; CANDOLFI, MARIANELA; VÍCTOR ROMANOWSKI; PIDRE MATÍAS LUIS

Valle Hermoso, Córdoba

Congreso; XLIII REUNIÓN CIENTÍFICA ANUAL DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE VIROLOGÍA; 2023

Sociedad Argentina de Virología

El baculovirus AcMNPV (Autographa californicaMultiple Nucleopolyhedrovirus) ha sido ampliamenteutilizado para la producción de bioinsumos. En esesentido, el mejoramiento de las tecnologías usadaspara la producción de AcMNPV recombinantes(recAcMNPV) resulta de interés. El objetivo de estetrabajo consistió en el desarrollo de un nuevo sistema58llamado PluriBAC, basado en la tecnología de clonadopor Golden Gate utilizando enzimas de restricción (ER)tipo IIS para el ensamblado simultáneo de múltiplesfragmentos en un mismo vector. PluriBAC consta detres niveles que permiten la combinación de módulos.Los vectores del nivel 1 poseen las secuenciascompatibles con los módulos provenientes del nivel 0.Asimismo, a partir del nivel 1, se obtendrá el plásmidodel nivel 2 con el ensamblado final de los múltiplesbloques. Mientras que los vectores del nivel 2contienen secuencias que permiten la recombinaciónhomóloga con el bácmido bApGOZA, plásmidos delnivel 1 se adaptaron para permitir la generación derecAcMNPV a través de trasposición en bacterias (Bac-to-Bac). La funcionalidad del sistema se evidenciómediante la generación de diferentes recAcMNPV queexpresan la proteína reportera Citrine: uno obtenidomediante recombinación homóloga a partir devectores de nivel 2 (Ac-GZ-Cit), y otro obtenido a partirde un vector de nivel 1 adaptado para el sistema Bac-to-Bac incluyendo además la resistencia al antibióticoEspectinomicina y las secuencias Tn7R y Tn7L (Ac-BtB-Cit). Las reacciones de Golden Gate fueron incubadas10 min a 37°C y 15 min a 16°C por 30 ciclos. LosrecAcMNPV se generaron mediante la co-transfecciónde células de insecto High Five con el vector de nivel 2y el bácmido o mediante la transformación delplásmido de nivel 1 en células DH10Bac, y la posteriortransfección de células de insecto con el bácmidorecombinante. Por un lado, el virus Ac-GZ-Cit fueutilizado para transducir células gliales tanto in vitrocomo in vivo. Para los ensayos in vitro, se incubaronastrocitos murinos y células G09 de glioblastomaderivadas de pacientes por 2 hs con el recAcMNPV(MOI = 750). En cuanto a los ensayos in vivo, seutilizaron ratones C57BI/6 naïve y portadores degliomas. Se inocularon los ratones con 5x10 8partículas virales por vía intracraneal. Pudimosobservar la expresión del gen reportero tanto encélulas en cultivo como en cortes de cerebros mediantemicroscopía de epifluorescencia. Por otro lado, laexitosa generación del Ac-BtB-Cit se evidenció enbacterias mediante la selección con el antibiótico, laaparición de colonias blancas en presencia de x-gal ymediante microscopía de epifluorescencia en célulasde insecto. En este trabajo presentamos un sistemaversátil, basado en Golden Gate, para la generación debaculovirus recombinantes. Presentamos a modo deejemplo dos baculovirus recombinantes generados con este sistema que conservaron las capacidadesintrínsecas de los mismos y algunas de sus posiblesaplicaciones.