Caracterización de bacterias degradadoras del herbicida 2,4-D nativas de un suelo agrícola.

ZABALOY, MARÍA CELINA; GÓMEZ, MARISA ANAHÍ

Rosario

Jornada; XIII Jornadas Argentinas de Microbiología. AAM, Filial Rosario; 2008

AAM - Universidad de Rosario

El herbicida ácido 2,4-diclorofenoxiacético es un análogo sintético de la auxina vegetal ácido 3-indolacético (AIA). Puede ser utilizado como fuente de C y energía por microorganismos del ambiente. Muchas de estas bacterias poseen genes de degradación homólogos a los genes tfd encontrados en Cupriavidus necator JMP134, la bacteria en la cual más se ha estudiado la degradación del 2,4-D. El gen tfdA codifica para la enzima dioxigenasa dependiente de α-cetoglutarato que hidroxila el 2,4-D en 2,4-diclorofenol (2,4-DCP). El gen tfdB codifica para la enzima 2,4-diclorofenol hidroxilasa que convierte el 2,4-DCP en 3,5-diclorocatecol. El objetivo de este trabajo fue realizar la caracterización fenotípica y genotípica e identificación de aislamientos de bacterias nativas de un suelo agrícola con la capacidad de utilizar el 2,4-D como sustrato de C. Se estudiaron 10 aislamientos de bacterias de suelo y dos cepas degradadoras de referencia, Alcaligenes sp. JD6 y Burkholderia cepacia TFD3. Se realizaron pruebas bioquímicas y se cuantificó la degradación del 2,4-D por cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Para la tipificación molecular se extrajo el ADN total y se realizó la amplificación por PCR de los genes de ARNr 16S, ARNr 16S-23S ITS, tfdA y tfdB. Los productos amplificados de cada PCR fueron visualizados por electroforesis en geles de agarosa al 1%. Los productos PCR de los genes tfdA y tfdB fueron digeridos con las enzimas de restricción AluI y HaeIII (RFLP) y los fragmentos de restricción se visualizaron por electroforesis en geles de agarosa al 2,5% (tfdA) o 3,5% (tfdB). El producto ARNr 16S fue purificado y secuenciado, las secuencias se alinearon con el software BioEdit y se compararon con secuencias en la base de datos GenBank. La caracterización fenotípica mostró bacilos Gram negativos móviles, formadores de colonias no pigmentadas, oxidasa positivos y catalasa negativos, reductores de nitrato, que utilizan ácidos carboxílicos y aminoácidos, pero no azúcares como fuente de C. Estas bacterias crecen en medio salino mineral suplementado con 1,1 mM 2,4-D como única fuente de C y energía, degradando el herbicida en menos de 72 h. Si bien no se detectó 2,4-DCP en el medio de cultivo, dado que es un metabolito muy lábil, se confirmó la presencia de los genes que intervienen en esta vía metabólica. Los patrones de bandas observados tanto del ITS como del RFLP de los genes tfd sugieren que nuestros aislamientos son genéticamente similares a Alcaligenes sp. JD6. La comparación con las secuencias en GenBank permitió identificar 5 aislamientos como Cupriavidus sp. con un 98% de similitud.