Estructura y función de la fosforilcolina fosfatasa de P. aeruginosa: Homólogos en otras bacterias del género Pseudomonas

BEASSONI, PR; DOMENECH, CE; LISA, AT

Editorial Académica Española

Lugar: Saarbrücken; Año: 2011 p. 208

978-3-8454-9264-3

En nuestro laboratorio se demostró que fosforilcolina fosfatasa de Pseudomonas aeruginosa es el producto del gen PA5292. Las bacterias crecidas con colina, betaína, dimetilglicina o carnitina como fuente de carbono, nitrógeno o carbono y nitrógeno, sintetizan PChP más fosfolipasa C hemolítica (PlcH) y acetilcolinesterasa (AChE). Al estar las tres enzimas involucradas en la patogenicidad de P. aeruginosa, el primer objetivo de nuestro trabajo fue conocer si otras especies del género, patógenas y no patógenas, mantenían la capacidad de sintetizar estas proteínas en similares condiciones de cultivo. Estudios bioquímicos, cinéticos y bioinformáticos indicaron que sólo PChP fue encontrada en otras Pseudomonas. Esto, más la importancia de esta enzima en el mecanismo de patogenicidad nos llevó a intensificar el estudio de la PChP de P. aeruginosa. La enzima expresada en E. coli, con y sin péptido señal, tiene propiedades catalíticas similares o idénticas a la enzima aislada del espacio periplásmico de P. aeruginosa. Cataliza la hidrólisis de fosforilcolina y p-nitrofenil fosfato, utilizando Mg2+, Zn2+ o Cu2+ como iones metálicos activadores. Las curvas de saturación mostraron que el péptido señal fue el factor responsable de la disminución de la eficiencia catalítica para ambos sustratos tanto a pH 5,0 como a pH 7,4. Aparentemente el primer sitio de afinidad está involucrado en la unión del sustrato conteniendo el grupo fosfato. El segundo sitio parece estar involucrado en el reconocimiento de la porción de amonio cuaternario. Las propiedades fisicoquímicas de la enzima recombinante indicaron que es una proteína globular monomérica con alto contenido en hélice. PChP tiene una estructura terciaria definida que puede modificarse por interacción con colina o Mg2+. PChP contiene los tres motivos característicos de la superfamilia haloácido dehalogenasa (HAD) que se ubican en las posiciones 31DMDNT35, 166SAA168 y K242/261GDTPDSD267. Considerando las coordenadas atómicas de la fosfoserina fosfatasa de Methanococcus janaschii se construyó un modelo molecular de la PChP utilizando técnicas de homología remota. La relevancia catalítica de los residuos aminoacídicos conservados fue determinada por mutagénesis sitio-dirigida. PChP comparte el mecanismo catalítico de todas las enzimas que pertenecen a la superfamilia HAD. En conclusión, el residuo D31 actuaría como nucleófilo que se fosforilaría durante la reacción de transferencia del grupo fosfato. El residuo de serina S166 orientaría al sustrato estableciendo uniones por puente hidrógeno, posibilitando el ataque nucleofílico. El residuo de lisina K242 neutralizaría la carga del intermediario fosforilado de enzima. Por último, D31 y D33 del motivo I más D262 y D267, del motivo III, participarían en la formación del bolsillo al cual se uniría el Mg2+.