Identificación de residuos aminoacídicos críticos en la actividad fosfolipasa C hemolítica de Pseudomonas aeruginosa

ZAFRA, MA; FORRELLAD, MA; BEASSONI, PR; LISA, AT

Huerta Grande - Córdoba

Congreso; Reunión Conjunta de Sociedades de Biología de la República Argentina; 2007

Sociedad de Biología de Córdoba

Fosfolipasa C hemolítica (PlcH) es uno de los principales factores de virulencia secretado por el patógeno oportunista P. aeruginosa. Es una enzima altamente conservada perteneciente a la superfamilia fosfoesterasas la cual incluye a fosfatasas ácidas y fosfolipasas C (PLCs) de otros Gram negativos. Estudios bioinformáticos de secuencia realizados en miembros de esta familia, demostraron residuos altamente conservados en PlcH como E60, T178, 151YAL160, Y235, L306 y H321. El propósito de este estudio fue determinar la función de estos residuos en la actividad catalítica de la enzima frente al sustrato fisiológico, fosfatidilcolina (PC). Para ello se determinó la actividad de proteínas recombinantes modificadas en tales residuos por mutagénesis sitio-dirigida. Se determinó la actividad indirectamente por valoración de Pi, acoplando una fosforilcolina fosfatasa a la reacción PLC. Además, se llevaron a cabo determinaciones cualitativas de actividad hemolítica y lecitinasa. Se observó que las proteínas mutadas en los residuos E60, T178 y H321 no poseen actividad, lo cual indica que estos residuos son esenciales en la catálisis. En cambio, las proteínas mutadas en  151YAL160, Y235 y L306 presentaron actividad comparable a la proteína nativa, indicando que si bien estos residuos están altamente conservados en PlcH no son indispensables en la actividad catalítica de esta enzima.