Aumento de la estabilidad de araujiaína, una fitoproteasa cisteínica, por inmovilización en perlas de alginato.

E. QUIROGA; C. ILLANES; J. MARCHESE; N.A. OCHOA; S. BARBERIS

Montevideo, Uruguay

Otro; IV Encuentro Regional de Biocatálisis y Biotransformaciones; 2010

El presente trabajo describe las propiedades de araujiaína (una fitoproteasa cisteínica) inmovilizada en perlas de alginato. Tal proceso de inmovilización fue llevado a cabo variando la concentración de alginato de sodio (1-4%, v/v) y la cantidad de enzima entrampada (0,5-25mg), encontrándose el máximo rendimiento de inmovilización (~91%) cuando se trabajó con una relación de 15mg de araujiaína/ml alginato al 2% (v/v). Bajo tales condiciones, se logró una alta eficiencia de entrampamiento ya que más del 98% del contenido de proteína total adicionada fue entrampada. La enzima inmovilizada mostró 88% de actividad luego de 72h de incubación y perdió menos del 5% de su actividad inicial luego de 45 días de almacenamiento a 4º C, indicando una buena estabilidad al almacenamiento. Araujiaína entrampada fue estable en un amplio rango de pH (entre 5 y 9,5) y mostró mayor actividad que la enzima libre luego de 120 min de incubación a 37, 50 y 60° C. Si bien, ambas formas, enzima libre y entrampada, fueron inactivadas luego de la incubación a 70º C, el catalizador inmovilizado mostró mayor termoestabilidad. Luego de la inmovilización, se observó un aumento en el valor de Km aparente y una disminución de la Vmax, debido a que el proceso de inmovilización limitó el acceso del sustrato al sitio activo de la enzima. Por medio de estudios espectrofotométricos FTIR, se demostró que araujiaína pudo adoptar una conformación similar a la nativa pero más activa y estable al ser retenida en perlas de alginato. Además, este estudio permitió confirmar el entrampamiento a nivel molecular. Finalmente, el catalizador inmovilizado fue aplicado a la síntesis de un precursor de un dipéptido amargo utilizado en la industria de los alimentos (Z-AlaPhe.OMe). Tal proceso de síntesis fue llevado a cabo en medio bifásico (acetato de etilo:buffer (50:50)) alcanzándose un rendimiento de síntesis aceptable al cabo de 48h de reacción. Este estudio demostró que araujiaína inmovilizada en perlas de alginato fue más resistente a cambios alcalinos y ácidos y más activa a altas temperaturas; observándose un 76% de recuperación de la actividad hidrolítica al cabo de 20 ciclos de reacción.  Estos hechos le confieren a dicho catalizador propiedades interesantes para su aplicación tecnológica.