Efecto del medio de reacción sobre la estabilidad de membranas de perlas de alginato utilizadas para la inmovilización enzimática.

E. QUIROGA; C. ILLANES; N.A. OCHOA

Salta

Congreso; VIII Congreso Ibero-Americano en Ciencia y Tecnología de Membranas; 2012

Universidad Nacional de Salta

Introducción y objetivo: Los procesos catalizados por enzimas son frecuentemente considerados para su aplicación en la industria debido a sus numerosas ventajas frente a los catalizadores convencionales no biológicos, dada su elevada estéreo y regioselectividad, condiciones moderadas de reacción, fácil manipulación y alta biodegradabilidad [1]. A pesar de estas ventajas, el uso de enzimas no se ha generalizado en los procesos químicos industriales ya que, al ser solubles en agua, se dificulta su separación de los sustratos y productos, impidiendo su reutilización. Además, las enzimas presentan estructuras lábiles e inestables frente a diversos factores físicos, químicos y biológicos, los cuales disminuyen su actividad catalítica y solubilidad en el tiempo [2]. La catálisis enzimática en fase heterogénea (enzimas inmovilizadas) ha permitido, por un lado, el uso más eficaz del catalizador al estabilizar la enzima y por otro, el desarrollo de procesos continuos con todas las ventajas operacionales asociadas, haciendo del proceso biotecnológico un proceso económicamente rentable. Una importante ventaja de la inmovilización de enzimas es la reutilización, incrementando así la productividad del proceso y disminuyendo el costo de operación [3]. Diferentes técnicas han sido desarrolladas para la inmovilización de enzimas. En particular, el método de inmovilización por entrampamiento es importante en aplicaciones farmaceúticas y en la industria de los alimentos. Tal metodología de inmovilización, de gran sencillez desde el punto de vista experimental, requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos y la enzima no sufre ninguna alteración en su estructura. Sin embrago, el entrampamiento requiere un control riguroso de las condiciones de gelificación, así como la comprobación de que la naturaleza química del proceso no altera los grupos reactivos de la proteína [4]. El entrampamiento de proteasas, tanto en perlas de alginato como en membranas poliméricas, ha permitido la obtención de derivados enzimáticos estables frente a diferentes condiciones de pH, temperatura y presencia de solventes orgánicos, haciéndolos catalizadores promisorios para su aplicación en la catálisis en medios orgánicos y en diferentes procesos industriales [4]. El objetivo del presente trabajo fue estudiar el efecto de medios de reacción sobre la estabilidad de membranas de perlas de alginato utilizadas para la inmovilización de una proteasa cisteínica (araujiaina) de interés para la industria de los alimentos. Metodología: Proceso de entrampamiento: El proceso de inmovilización se llevó a cabo variando la concentración de alginato de sodio (0,5-4%, v/v) y la cantidad de enzima entrampada (0,5-25mg) por mL de alginato. Las perlas se formaron haciendo gotear 15mL de alginato de sodio conteniendo la enzima, a través de una jeringa con una aguja de 1mm de diámetro dentro de una solución de 200mL de CaCl2 0,1M. Luego de 30 min de agitación suave, las perlas fueron lavadas y almacenadas a 4° C. Ensayos mecánicos: Las perlas de alginato de sodio se incubaron en buffer Tris-HCl (0,1M, pH 8,5) y en acetato de etilo (50% en buffer) a 37° C y con agitación orbital (160 rpm). Al cabo de diferentes tiempos de incubación (0 a 170h) se separaron 4 perlas de cada medio para llevar a cabo los ensayos de propiedades mécanicas. Tales ensayos se realizaron a 25º C utilizando un equipo ?Comten Industries? Serie 94 VC. Los resultados obtenidos fueron un valor promedio de cuatro muestras. Medida de la actividad enzimática: La actividad hidrolítica fue medida en buffer Tris-HCl (0,1M, pH 8,5) utilizando BAPNA como sustrato, luego de 5 min de incubación a 37º C. La actividad sintética fue determinada en acetato de etilo (50% en buffer) siguiendo la formación del dipéptido Z-Ala-Phe.OMe, luego de 48h de incubación a 37º C. Resultados y discusión: El máximo rendimiento de inmovilización (definido como la relación de actividad enzimática antes y después de la inmovilización) fue de 91% con una relación de 15mg de araujiaína/mL de alginato al 2% (p/p). Cuando la concentración de alginato fue de 0,5 a 1%, hubo pérdida de la enzima debido a la formación de un débil entrecruzamiento. Cuando se trabajó con alginato al 4% se obtuvo una buena consolidación de las perlas aunque la actividad enzimática fue menor que al utilizar alginato al 2%. Esta disminución en el rendimiento de inmovilización con el incremento en la concentración de alginato de sodio fue debido a un aumento en la densidad del gel formado (mayor restricción difusional). Por otra parte, al variar la cantidad de enzima entrampada se observó una directa relación del rendimiento de la inmovilización con la cantidad de enzima inmovilizada, hasta un valor de 15mg enzima/mL de alginato, correspondiendo al máximo valor obtenido. Esto podría explicarse por una saturación del soporte de inmovilización. Bajo tales condiciones, se logró una alta eficiencia de entrampamiento: alrededor del 98% del contenido total de proteína fue inmovilizada no observándose una lixiviación de la misma durante el proceso catalítico. La Figura 1 muestra el efecto de buffer y acetato de etilo (50% en buffer) sobre la estabilidad de la membrana de las perlas de alginato. Luego de 170h de incubación, las membranas de las perlas de algino sólo perdieron un 30% de resistencia en acetato de etilo y un 25% en buffer, observándose una disminución en la resistencia de la membrana con el aumento en la polaridad del medio Debido a estos resultados se hicieron ensayos para evualuar la estabilidad operacional de la enzima inmovilizada (determinada como número de ciclos de reacción enzimática) en los medios estudiados. Al cabo de 20 ciclos de hidrólisis, araujiaían mantuvo el 78% de su actividad (Fig. 2a). En tanto que, mostró un 65% de su actividad al cabo de 8 ciclos de reacción de síntesis en acetato de etilo (50% en buffer) (Fig 2b). Tales ensayos muestran que alginato de sodio es un buen soporte para la enzima y que el mismo podría ser utilizado en procesos continuos sin que la enzima pierda eficiencia. Referencias: [1] F. Bordusa. Proteases in organic synthesis, Chem. Rev. 102 (2002) 4817-68. [2] A. Illanes. Stability of biocatalysts, Electron. J. Biotech. 2 (1999) 1-9. [3] A. Illanes. Enzyme biocatalysis: principles and applications, Springer Science (2008). [4] R.A. Sheldon. Enzyme immobilisation: The quest for optimum performance, Adv. Synth. Catal. 349 (2007) 1289-307.