Clonado, expresión, purificación y caracterización del Inhibidor Secretorio de Proteasas Leucocitario Humano (ISPL)

MAFFIA P; TATEOSIAN N; ANTON E; CHULUYAN E

Mar del Plata, Argentina

Congreso; LI Reunión Annual de la Sociedad Argentina de Inmunología (SAI).; 2003

  El gen correspondiente al péptido maduro del ISPL se amplificó a partir de ARNm de una línea celular y fue clonado en un vector de expresión (pET22b+) agregándole 6 His C-terminal. Se examinaron varias cepas de E.coli en su capacidad de expresión de ISPL seleccionándose la cepa BL21 CodonPlus(DAE) RIL (con expresión inducible y codones mutados para genes eucariotas). La purificación se llevó a cabo con una resina de Níquel-agarosa. La actividad de la proteína recombinante fue evaluada y corroborada realizando ensayos de inhibición de tripsina utilizando un sustrato cromogénico. Dado que el ISPL es un policatión el siguiente paso fue evaluar la actividad enzimática de la proteína agregándole un polianión como el ADN genómico. El agregado de ADN a la solución de ISPL resultó en aumento significativo de la actividad inhibitoria de tripsina (>25% p<0.001). Además, la actividad anti-inflamatoria del rhSLPI fue examinada en ratones en un modelo de inflamación aguda que evalúa el reclutamiento de leucocitos. El tratamiento de los ratones con rhISLP demostró una disminución de la migración de leucocitos en aproximadamente un 20 % comparado con los controles.