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A nivel mundial, los anfibios y peces han ido disminuyendo sus poblaciones a un ritmo alarmante, siendo la contaminación por agroquímicos una de las causas que explican este fenómeno. El acetoclor es uno de los herbicidas más utilizados registrándose su presencia muy frecuentemente en cuerpos de agua de agroecosistemas afectando severamente los organismos que allí habitan. El objetivo de este estudio fue evaluar comparativamente la toxicidad aguda (hasta las 96 h) y crónica (336 h) de un formulado comercial del herbicida acetoclor (Harness®, 90% i.a) en dos especies acuáticas autóctonas, adultos de Cnesterodon decemmaculatus (madrecitas de agua) y larvas de Rhinella arenarum mediante bioensayos estandarizados. Los valores de CL50-48, 96, 168 y 336 h fueron de 1,98, 1,11, 0,92 y 0,771 mg/L en madrecitas, y de 6,22, 4,81, 4,37 y 3,24 mg/L en larvas respectivamente. Estos resultados indican que las madrecitas fueron más sensibles al herbicida que las larvas de anfibio. La exposición al acetoclor causó efectos subletales tanto en larvas como en las madrecitas desde las primeras 24 h a partir de 2,5 mg/L (LOEC), destacándose edemas, curvaturas del eje, microcefalia y alteraciones en el comportamiento (debilidad y ausencia en el movimiento) en larvas, y solo alteraciones etológicas (natación en la zona superior de la pecera, movimientos erráticos o circulares y falta de equilibrio) en madrecitas. Estos resultados evidencian la utilidad de los bioensayos de toxicidad estandarizados con especies nativas sensibles para contribuir a la sostenibilidad ambiental y para fines de conservación de las especies.