CAMBIOS EN LA TRANSFERENCIA DE ENERGIA DE FLUORESCENCIA DE LA MUTANTE BFP-PMCA-GFP ASOCIADOS A LA ACTIVACION DE LA PMCA POR CALMODULINA Y FOSFOLIPIDOS ACIDOS.

CORRADI G.R; ; ADAMO H.P.

Mar del Plata Buenos Aires

Congreso; Congreso conjunto de sociedades Biomédicas; 2004

La PMCA es activada por unión de la calmodulina a un dominio de autoinhibición localizado en el extremo C-terminal de la molécula produce  un aumento de la afinidad por Ca2+ y ATP y de la velocidad máxima de transporte. Se ha propuesto que el mecanismo de inhibición-activación de la PMCA involucra el acercamiento y alejamiento del extremo regulador C-terminal al sitio activo de la enzima. Para estudiar los cambios conformacionales asociados con la autoinhibición de la PMCA y la  activación del transportador por calmodulina, utilizamos FRET (fluorescence resonance energy transfer) entre dos proteínas fluorescentes [BFP (blue fluorescent protein) y GFP (green fluorescent protein)] fusionadas por ingeniería genética en el extremo N y C terminal de la PMCA (BFP-PMCA-GFP). De acuerdo a los resultados obtenidos por FRET, la unión de calmodulina a su sitio regulatorio en el extremo C-terminal, aleja este segmento de la región central catalítica que incluye parte del extremo N-terminal de la molécula, con la consecuente disminución de la eficiencia de  transferencia de energía de la BFP (dador) al aceptor (GFP). Dicha reducción se produjo a concentraciones de  calmodulina similares a las necesarias para activar la PMCA. Estas variaciones en las medidas de FRET para la BFP-PMCA-GFP, serian consecuencia  de un distanciamiento promedio de 5 A°, entre los fluoróforos. En concordancia con esta hipótesis propuesta, el agregado de EGTA, produce un aumento en la eficiencia de transferencia, que indicaría un acercamiento de los fluoroforos, resultado del desprendimiento de la calmodulina, por reducción del calcio libre del medio. En presencia de fosfolípidos ácidos no se observaron variaciones significativas frente al agregado de calmodulina, lo cual podría indicar que la enzima se encuentra parcialmente activada por los mismos.