Presentacion Oral .Producción, purificación e inmovilización de inulinasa fúngica

MICAELA ROLDAN; EVELYN WAGNER; M. LAURA CARBAJAL; NATALIA L. ROJAS

CABA

Taller; Primer Taller Biotecnología aplicada a la Tecnología de Alimentos; 2019

Universidad Tecnológica Nacional, Facultad Regional Buenos Aires.

Las inulinasas son enzimas de aplicación en la industria de alimentos para la producción de prebióticos, jarabe de fructosa, entre otros. Esta enzima degrada inulina generando fructooligosacáridos (FOS), considerados prebióticos, en un único paso y con un rendimiento de alrededor del 80%. Una alternativa conveniente para la aplicación industrial de estas enzimas es su inmovilización para desarrollar biorreactores enzimáticos. Estos sistemas incrementan la estabilidad y la actividad de la enzima para soportar condiciones de reacción adversas, permiten su reutilización y mejoran la etapa de recuperación del producto.En este marco, se propone producir, purificar e inmovilizar una inulinasa fúngica ácido-estable, recombinante expresada en Pichia pastoris, cuyas características bioquímicas le otorgan un potencial de aplicación en procesosindustriales, con la intención de generar un reactor enzimático para la producción de prebióticos. Se plantea primero estudiar la producción de la proteína recombinante y su recuperación; y luego estudiar y caracterizar suinmovilización sobre soportes de polietileno de alta densidad (HDPE) porosos (70%) y modificados por copolimerización radioinducida (desarrollados previamente por el grupo de trabajo) y posteriormente derivatizados químicamente. Si bien se han reportado trabajos de inmovilización de este tipo de enzimas, los polímeros comúnmente utilizados como agar, agarosa, alginato ó quitosano presentan inconvenientes de resistencia mecánicas y baja durabilidad. Debido a esto, resulta necesario abordarlo desde el uso de matrices robustas y económicas, de manera de poder desarrollar un proceso enzimático transferible al sector productivo.En este trabajo, se han realizado cultivos de alta densidad en un reactor de 5 l con un perfil de alimentación adecuado. Se han optimizado las condiciones de los procesos de recuperación involucrados (centrifugación y ultrafiltración) alcanzando rendimientos del 60% con 90% de grado de pureza. Se ha evaluado la factibilidad de incorporar cromatografías de intercambio iónico para obtener mayor grado de pureza. Se ha realizado la síntesis del soporte base de HPDE poroso mediante copolimerización por injerto por radiación gamma 60Co conmonómeros de Glicidilmetracrilato (GMA) y Dimetilacrilamida (DMAA). El sistema elegido entre los obtenidos ha sido el HDPE con copolímero de GMA:DMAA (1:3), 6% de grado de injerto, y capacidad del orden de 60 µmoles Cu2+/g de soporte. En relación a la inmovilización se han desarrollado tres técnicas diferentes, para las cuales el material ha sido derivatizado de forma tal de obtener grupos aminos, carboxilos o epóxidos disponibles a los que se les pueda unir la enzima covalentemente. Con este sistema, se ha inmovilizado y evaluado la actividadenzimática resultante en distintas condiciones.Se espera que el presente proyecto permita desarrollar un proceso enzimático robusto con el potencial de ser transferible al sector industrial para la generación de este tipo de bioinsumos.