CLONADO DE UNA INULINASA DE ASPERGILLUS KAWACHII EN PICHIA PASTORIS

N.L. ROJAS; CHESINI, M.; CAVALITTO, S. F; HOURS R.A.

Posadas

Congreso; XII Congreso Argentino de Micología; 2011

Las inulinasas microbianas o β-(2→1) fructanohidrolasas son enzimas que hidrolizan enlaces β-(2→1)fructano en la inulina y se utilizan para la producción de jarabe de fructosa, oligofructosacáridos y etanol o acetona-butanol a partir de residuos de especies vegetales. Estos productos son ampliamente utilizados en las industrias farmacéutica y alimentaria (jarabes fructosados, bebidas, helados, entre otros). El objetivo de este trabajo fue llevar a cabo el clonado del gen de una inulinasa desde el ADN genómico de Aspergillus kawachii en el sistema de expresión heterólogo de Pichia pastoris. Para la purificación de ADN genómico se realizó un cultivo A. Kawachii IFO 4308 en medio líquido. Se amplificó el gen inulinasa a partir de primers diseñados en base a la secuencia aminoacídica N-terminal de una inulinasa purificada del género Aspergillus y la secuencia aminoacídica consenso VEVFGGQGE. El producto de PCR y el plásmido pPIC9, utilizado como vector de expresión inducible, fueron digeridos con las enzimas de restricción XhoI y AvRII y ligados, generando la construcción pPic9:inu. Dicha construcción fue transformada en células de E. coli DH5. Una vez obtenidos los clones conteniendo la construcción, esta fue secuenciada para verificar el correcto marco de lectura del gen. De los clones analizados, se utilizó uno de ellos como fuente del plásmido recombinante para transformar células de Pichia pastoris GS115 (His-, Mut+) competentes. Para ello, fue necesario linealizar el plásmido mediante la digestión con BglII para aumentar la eficiencia de transformación. Las células transformadas fueron capaces de crecer en medio mínimo sin histidina y a partir de este cultivo se seleccionaron cinco clones y se estudió la expresión de la inulinasa recombinante mediante determinaciones de actividad enzimática y SDS-PAGE. Si bien fue posible clonar el gen que codifica para la inulinasa, y este presenta un marco de lectura abierto correcto (verificado por secuenciación), no se detectó la presencia de una proteína que se correspondiera al tamaño de la inulinasa ni actividad enzimática en los extractos de cultivo de P. pastoris recombinante. Una posible explicación radica en la presencia de un intrón en el gen clonado y que la levadura no fue capaz de realizar el corte y empalme del mismo en forma correcta. Se plantea para un futuro eliminar dicho intrón in vitro para conseguir la expresión de la proteína activa y posteriormente optimizar las condiciones de producción a los efectos de aplicarla en procesos biotecnológicos.