Análisis de la oxidasa alternativa de naranja

MORÁN BARRIO, J.; CHECA, S. K.; OTTADO, J. Y ORELLANO, E. G.

Regente Palace Hotel, Ciudad Autónoma de Bs As, Argentina.

Simposio; Vº Simposio Argentino de Biotecnología Vegetal, REDBIO.; 2002

El objetivo de este trabajo ha sido la caracterización a nivel molecular de los genes que codifican para la oxidasa alternativa de Citrus sinensis (naranjo). Introducción. Las plantas presentan dos vías de transporte de electrones mitocondriales: la vía clásica o citocrómica y la vía alternativa. Esta última se carabcteriza por la presencia de un única enzima insensible al cianuro denominada oxidasa alternativa (AOX), que no genera gradiente protonmotriz y disipa la energía en forma de calor. Esta enzima es codificada por una familia multigénica en la mayoría de las plantas, siendo de codificación nuclear y posteriormente importada a la mitocondria. Su papel fisiológico es bastante discutido y su función es importante en distintos tipos de estrés, tanto biótico como abiótico. Metodología. Se aisló y purificó ADN genómico de hojas de naranjo utilizándose una combinación del método de aislamiento de núcleos y CTAB. Se realizó la amplificación por PCR de un fragmento de 450 pb altamente conservado correspondiente al exón 3´ del gen de la AOX utilizando oligonucleótidos degenerados basados en el apilamiento de los genes secuenciados disponibles en las bases de datos. Los fragmentos obtenidos fueron clonados en el vector pGEM-Teasy (Promega) y los diferentes clones fueron analizados por polimorfismo de restricción con la enzima AluI. Una variante de cada tipo polimórfico fue secuenciada. Resultados y Discusión. Se caracterizaron tres polimorfismos de restricción diferentes en el fragmento amplificado de AOX de naranjo: grupo 1 (ORA1, no presenta restricción), grupos 2 y 3 (ORA2 y ORA3, presentan restricción asimétrica y simétrica respectivamente). La comparación de las secuencias de nucleótidos entre los 3 clones reveló una alta identidad entre ORA 2 y 3. El análisis de comparación de aminoácidos de cada clon contra la base de datos reveló que ORA 1 es altamente homóloga a la AOX tipo 1 (92 %) y ORA 2 y 3 altamente homólogas a la AOX tipo 2 (97 y 87 %). Se estudió también la expresión de la AOX en extractos de hojas de naranjo mediante Western Blot utilizando anticuerpos monoclonales contra la AOX de Sauromatum guttatum, una planta termogénica. Se observó una única y débil señal correspondiente a la forma dimérica de la enzima (70 kDa). Conclusiones. Se identificaron dos tipos de genes que codifican para la AOX en naranjo: AOX tipo 1 y tipo 2 con alta homología a otras plantas dicotiledóneas.