Expresión génica de enzimas ADN metiltrasferasas en células epiteliales de oviducto bovino

BARRERA, DANIEL; GARRAPPA, GABRIELA; GARCÍA, E. VANESA; MICELI, DORA C.

San Miguel de Tucumán, Tucumán (Argentina)

Jornada; V Jornadas de Jóvenes Investigadores de la UNT; 2012

Universidad Nacional de Tucumán-Secretaria de Ciencia y Técnica

El oviducto juega un papel fundamental en la reproducción en mamíferos, proporcionando un microambiente óptimo para el ovocito, la capacitación espermática, fecundación y desarrollo embrionario inicial. Se ha demostrado que el epitelio oviductal sufre marcados cambios morfológicos y funcionales dependientes de las hormonas sexuales durante el ciclo estral y la presencia de las gametas y el embrión. Dichos cambios influyen directamente sobre la secreción oviductal, sugiriendo que su composición presenta modificaciones dinámicas, lo que estaría relacionado con cambios en la transcripción génica en las células oviductales. Un gran número de genes son estimulados o inhibidos en las diferentes etapas del ciclo estral en las células epiteliales del oviducto lo cual sugiere un complejo mecanismo de expresión de los mismos. Sin embargo, muy poco es conocido acerca de los mecanismos moleculares involucrados en la regulación de la expresión de estos genes en el oviducto en mamíferos. La regulación epigenética, incluyendo la metilación del ADN, cumple un rol fundamental en la regulación de la trascripción en células de mamíferos. Esta marca epigenética se produce por la adición de un grupo metilo al residuo de citosina en dinucleótidos CpG localizados en regiones específicas del ADN. La metilación del ADN es catalizada por enzimas ADN metiltransferasas (DNMTs), entre las que se incluyen DNMT1, que cumple la función de mantener los patrones de metilación del ADN y DNMT3a y DNMT3b involucradas en el establecimiento de la metilación de novo. Una desregulación del sistema DNMT-metilación puede causar alteraciones patológicas. Por ejemplo, se ha observado la expresión aberrante de los genes DNMTs en la endometriosis en humanos. Debido a que la expresión de genes en el oviducto podría regularse a través de mecanismos epigenéticos como la metilación del ADN es que nos planteamos como objetivo en este trabajo estudiar la expresión de genes DNMT en células epiteliales del oviducto bovino. Oviductos bovinos se obtuvieron después de la faena de vacas en un frigorífico local. Se recolectaron ovarios asociados a sus respectivos oviductos de cada animal y se transportaron en frío hasta el laboratorio. Para establecer la etapa del ciclo estral en la que se encontraba cada hembra se utilizó como criterio de clasificación el aspecto morfológico de los ovarios. Se seleccionaron oviductos de vaca en proestro (estadio preovulatorio), metaestro y diestro (estadio postovulatorio). Los oviductos se separaron de los ovarios y mesenterios y se dividieron en las regiones de ámpula e istmo. Se cortaron longitudinalmente las regiones y se obtuvieron por raspado mecánico con bisturí las células epiteliales del oviducto. Las células se recolectaron en PBS y posteriormente se lisaron en TriReagent (1ml) para la extracción de ARN total de acuerdo a protocolo descripto por el fabricante. Luego de la cuantificación en espectrofotómetro a 260 nm, 1 microgramo de ARN aislado de células de ámpula e istmo de cada estadio del ciclo se retrotranscribió a cDNA utilizando la enzima M-MLV y oligodT como cebador. Se amplificaron por PCR transcriptos de DNMT1 (134 pb), DNMT3a (128 pb) y DNMT3b (129 pb) utilizando el siguiente programa: 94°C 2 min; 30 ciclos de 94°C 15 seg, 58°C 30 seg y 72°C 30 seg; y una extensión final a 72°C por 7 min. Como gen de referencia se amplificó B-actina (150 pb). Los productos de amplificación se separaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1,5% conteniendo SybrGreen y se determinaron los niveles de expresión analizando las intensidades de los productos con el programa ImageJ. Los resultados obtenidos mostraron que tanto en la región del ámpula como del istmo se expresan DNMT1, DNMT3a y DNMT3b a lo largo del ciclo estral. DNMT1 presenta mayores niveles de trascripción con respecto a DNMT3a y DNMT3b en todas las etapas del ciclo estral en ambas regiones analizadas. La expresión de estos genes en el oviducto bovino nos permite sugerir que sus productos proteicos puedan tener funciones regulatorias sobre la expresión génica y considerar a la metilación del ADN como un posible mecanismo de regulación del transcriptoma oviductal.