Inhibición de Clostridium difficile por Lactobacilos y bifidobacterias

TREJO, FM, MINNAARD, J, PÉREZ, P.F, DE ANTONI, G.L,

Buenos Aires – Argentina

Congreso; Noveno Congreso Argentino de Farmacia y Bioquímica Industrial; 2002

Introducción:El tracto gastrointestinal contiene un complejo  ecosistema de microorganismos que actúan como barrera natural contra la colonización por enteropatógenos. El tratamiento con antibióticos es una de las causas por las cuales esta barrera puede alterarse permitiendo la infección enteropatógena del individuo. Clostridium difficile, anaerobio formador de esporos, es un importante patógeno nosocomial capaz de establecerse en el intestino de pacientes cuya flora intestinal fue alterada por el tratamiento con antibióticos (clindamicina, cefalosporina y ampicilina). Una vez establecido, el organismo es capaz de causar desde una leve diarrea hasta un importante cuadro de colitis pseudo membranosa (PCM). Se ha demostrado que Clostridium difficile produce dos toxinas El mecanismo de acción de ambas toxinas no está aún claramente definido pero se sabe presentan el mismo efecto letal al ser inyectadas parenteralmente en animales pudiendo actuar sinergicamente en el intestino. Objetivos: Seleccionar cepas de Bifidobacterium y Lactobacillus con capacidad para inhibir el desarrollo y adhesión de Clostridium difficile a células epiteliales in vitro. Materiales y Métodos: Se trabajó con cepas de Clostridium difficile de referencia ATCC 43593 y ATCC 9689. Las mismas se crecieron en BHI bajo condiciones anaeróbicas. Los ensayos de inhibición se realizaron por el método de difusión en agar (DMCR-agar )colocando sobrenadantes de lactobacilos y bifidobacterias aislados e identificados en el CIDCA. La adhesión de las cepas de Clostridium difficile y la inhibición por sobrenadantes de bifidobacterias se ensayó sobre células de epitelio intestinal humano (línea Caco-2, pasaje 54 de 20 días). Las mismas se dispusieron en placas de 24 fosas sobre vidrios en medio DMEM suplementado con 20% de suero fetal bovino. La adesión se cuantificó mediante recuento microscópico de cultivos teñidos Resultados: En los ensayos de inhibición de sobrenadantes de bifidobacterias sobre el crecimiento de Clostridium difficile en medio sólido se encontró una relación lineal entre el diámetro del halo de inhibición y el pH. Mediante un  análisis de regresión se pudieron seleccionar cepas de bifidobacterias con alta capacidad inhibitoria (CIDCA 531, 532, 536,538, 5315, 5325 y 5326). La composición en ácidos orgánicos de los sobrenadantes de las bifidobacterias estudiada por HPLC, reveló que los ácidos láctico y acético se encuentran en mayor proporción y en menor proporción ácido oxálico, málico, oxalacético, pirúvico y fórmico. En algunos casos se determinó la presencia de ácido propiónico. Para algunas cepas se encontró una correlación entre el pH, la concentración de ácidos y el poder inhibitorio. En otros casos se sospecha  la presencia de otros factores inhibitorios presentes en el sobrenadante. El sobrenadante de la cepa 533 disminuyó la adherencia de dos cepas de Clostridium difficile respecto a los sobrenadantes de las cepas 538 y 5313, que sólo redujeron la adherencia de una de ellas. La incubación de las bacterias de Clostridium difficile y las células epiteliales en presencia de sobrenadantes de bifidobacterias provoca una alteración en la capacidad de adherencia a enterocitos. Los mecanismos por los cuales esta adherencia es afectada pueden ser varios: la presencia en los sobrenadantes del agente responsable de dicho efecto, el cual puede unirse a los receptores de la bacteria, de la célula eucariota o de ambos. También es posible que se produzca una alteración de los receptores que permiten la interacción entre los microorganismos y las células epiteliales. Conclusiones: Algunas de las cepas estudiadas podrían ser potenciales candidatos para realizar estudios in vivo en vistas a la futura formulación de un probiótico intestinal.