Análisis de las regiones/aminoácidos implicados en la interacción entre la proteína Z y la nucleoproteína, relevantes para la formación de partículas de tipo viral en arenavirus

LEVINGSTON JM; CASABONA JC; GÓMEZ G; LOUREIRO ME; LÓPEZ N

Buenos Aires

Congreso; IX Congreso Argentino de Virología; 2008

Sociedad Argentina de Virología

El virus Tacaribe (VTac) es el prototipo de los arenavirus del Nuevo Mundo y conforma un linaje filogenético con los patógenos productores de fiebres hemorrágicas conocidos en Sudamérica, entre los que se cuenta el virus Junín (VJun). Los arenavirus son virus envueltos, cuyo genoma está constituido por dos segmentos de ARN de cadena simple (llamados S y L). El ARN S codifica para la nucleoproteína (N) y para el precursor de las glicoproteínas de envoltura (GPC). El ARN L codifica para una ARN polimerasa ARN dependiente (proteína L) y para la proteína Z, que contiene un dominio RING. Los ARNs genómicos están asociados a la proteína N formando las ribonucleoproteínas (RNPs), las cuales son el templado para la transcripción y la replicación del ARN viral. La proteína Z tiene un rol central en la morfogénesis viral y se ha demostrado que puede inducir la formación de partículas de tipo viral (PTVs), cuando se la expresa en células eucariotas en ausencia del resto de los componentes virales. Nuestro grupo ha desarrollado un sistema de genética reversa que dirige la replicación y la incorporación de un minigenoma a PTVs, en células que expresan un ARN análogo al ARN S de VTac, las proteínas L y N de VTac y las proteínas Z y GPC de VJun, a partir de plásmidos transfectados. Utilizando este sistema, hemos encontrando previamente que Z es la única proteína viral implicada en la incorporación de N a las PTVs. Mas aun, en células que expresan únicamente Z y N, encontramos que N es incorporada a las PTVs donde se encuentra protegida por una envoltura lipídica. Con el objetivo de identificar los aminoácidos (aa)/motivos de Z involucrados en la incorporación de N a las PTVs, generamos una serie de mutantes puntuales de Z. Las PTVs formadas luego de la coexpresión de las mutantes de Z con la proteína N se analizaron por Western blot. Además, las mutantes de Z fueron ensayadas en el contexto del sistema completo, en el cual la presencia de RNPs en las PTVs obtenidas se analizó mediante ensayos de infección. Las posibles interacciones entre las mutantes de Z o la proteína Z salvaje y N fueron analizadas por microscopia confocal y mediante ensayos de coinmunoprecipitación. Por otra parte, iniciamos el mapeo de las regiones de N involucradas en la interacción con Z. Con tal fin, se generaron mutantes por deleción de la proteína N. Se ensayó la incorporación a PTVs de las mutantes de N luego de la coexpresión con Z. Además, se realizó el análisis funcional de las mutantes de N en el contexto del sistema de genética reversa. Los datos obtenidos indican que los residuos L49 y L79 así como la integridad de la estructura RING en Z, son esenciales para: i) la transferencia del minigenoma a células frescas por las PTVs producidas en el sistema completo, ii) la incorporación de N a PTVs obtenidas luego de la coexpresión de N y Z en ausencia de otros componentes del sistema y iii) para la interacción entre N y Z. Los resultados indican además que el extremo C-terminal sería la región de N involucrada en la incorporación de esta proteína a las PTVs. conclusión: Nuestros resultados sustentan la hipótesis de la incorporación de las nucleocápsides a las partículas virales en forma dependiente de la interacción entre N y Z.