ESTRATIFICACIÓN FISIOLÓGICA Y TOLERANCIA ANTIBIÓTICA EN EL CONTEXTO ESPACIAL DE BIOFILMS BACTERIANOS

SAMBRAILO, A.; SERRA, D.O.

Rosario

Jornada; Jornadas de Ciencia y Tecnología 2021 de la FBIOyF de la UNR; 2021

Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéutica (FBIOyF), Universidad Nacional de Rosario

Introducción. La gran mayoría de las infecciones bacterianas crónicas, entre ellas las causadas por Escherichia coli, se asocian con la formación de biofilms. Se trata de comunidades multicelulares que las bacterias forman a partir de una matriz extracelular (MEC). En estas comunidades, subpoblaciones de células toleran y sobreviven a los tratamientos antibióticos, lo cual facilita la persistencia de las infecciones. A pesar de los esfuerzos de investigación, aún no se ha logrado comprender acabadamente en qué regiones de la compleja estructura de los biofilms las bacterias toleran mejor los tratamientos antibióticos y qué mecanismos moleculares ponen en juego esas subpoblaciones bacterianas para sobrevivir a los antibióticos. Para entender estos aspectos, una condición previa indispensable es conocer cómo las bacterias se diferencian fisiológicamente en el contexto espacial de los biofilms. En línea con este planteo, previamente, empleando biofilms de tipo macrocolonias como sistema modelo y técnicas de microscopía, hemos descubierto que células de E. coli se diferencian fisiológicamente en respuesta a gradientes de nutrientes generando en las macrocolonias dos estratos: (i) un estrato inferior, próximo al agar (la fuente de nutrientes), conformado por bacterias en forma de bastón y flageladas que reflejan un crecimiento vegetativo de tipo ?post-exponencial?, y (ii) un estrato superior, alejado del agar y en contacto con el aire, ocupado por bacterias ovoides que producen MEC, que reflejan una fisiología de tipo ?fase estacionaria?. Más recientemente, a partir de análisis microscópicos empleando fusiones de promotores de genes marcadores de estados fisiológicos a genes reporteros fluorescentes, hemos descubierto que cada estrato se subdivide a su vez en zonas de crecimiento vegetativo y de fase estacionaria que no surgen sólo de gradientes de nutrientes, sino más bien de la integración de gradientes de nutrientes y oxígeno que operan en sentido opuesto. Resultados. Sobre la base de los antecedentes descriptos, nos propusimos investigar cómo influye esta compleja estratificación fisiológica en la tolerancia antibiótica de células individuales de E. coli en biofilms. Para ello, biofilms de tipo macrocolonia de E. coli AR3110 pre-crecidos sobre membranas fueron tratados con antibióticos (50 g/ml Kanamicina o 100 g/ml Ampicilina, control sin antibiótico) y luego sujetos a tinción diferencial de células muertas con yoduro de propidio. Posteriormente, los biofilms fueron crioseccionados y los cortes resultantes fueron examinados mediante microscopía de fluorescencia. Destacadamente, los resultados obtenidos mostraron un patrón de muerte bacteriana localizada para ambos antibióticos que espacialmente coincide con la zona de crecimiento vegetativo en el estrato inferior y que, adicionalmente, en macrocolonias tratadas con kanamicina, se replica en la segunda zona de crecimiento vegetativo que ocurre en el estrato superior. Se observó que la muerte de células individuales fue además acompañada por cambios morfológicos distintivos para cada antibiótico. Por el contrario, no se evidenció muerte bacteriana en las zonas de fase estacionaria de ambos estratos, indicando una notable y diferencial tolerancia a los antibióticos de las bacterias en estas zonas.Conclusiones. Estos estudios nos permitieron revelar por primera vez, a nivel de células individuales, la existencia de un patrón espacial diferencial de muerte y tolerancia bacteriana a los antibióticos en biofilms de tipo macrocolonia.