INVESTIGADORES
DEL PAPA Maria Florencia
congresos y reuniones científicas
Título:
Construccion de un nuevo transposon mini-Tn5 portador de un origen de replicación bacteriano para su uso en estudios RIVET en rizobios
Autor/es:
SALAS ME, LOZANO MJ , MARTINI MC, SALTO IP, TORRES TEJERIZO GA, GIUSTI MA, DEL PAPA MF, PISTORIO M, LAGARES A.
Reunión:
Congreso; Asociación argentina de microbiología; 2010
Resumen:
Introducción: Los rizobios son bacterias gram-negativas que
habitan el suelo y se caracterizan por fijar nitrógeno atmosférico cuando se
asocian en simbiosis con plantas leguminosas. Dicha asociación es el
resultado de un conjunto de eventos de señalización cuyos genes asociados no
han sido aun del todo caracterizados. La técnica RIVET (Recombination
based In Vivo Expression Technology) permite identificar genes que, en
una condición particular, se expresan de modo diferencial respecto de una
condición fisiológica de referencia. En nuestro laboratorio se ha
desarrollado una variante de la técnica RIVET que usa un transposón derivado
del Tn5 como herramienta para generar fusiones transcripcionales a lo largo
del genoma al gen de una resolvasa (tnpR) localizada en un extremo del
transposón. La expresión de TnpR en clones específicos resultará en la
escisión de un cassette de DNA que cambiará el fenotipo de la bacteria
indicando que el gen fusionado a la resolvasa en dicho clon se ha expresado. Objetivos:
Construcción de un nuevo MiniTn5 portador de un origen de replicación (oriV)
bacteriano funcional en E. coli que facilite la recuperación de
secuencias flanqueantes al transposón en clones que resulten de interés luego
de la aplicación de la técnica RIVET. Materiales y Métodos: Medios de
cultivo complejos TY, LB. Conjugaciones bacterianas siguiendo protocolos
clásicos. Técnicas moleculares según Maniatis et al. (1982). Resultados: Se
clonó un origen de replicación funcional en E. coli proveniente del
plásmido pSM10 dentro del sitio NotI presente en un transposón
mini-Tn5, haciendo uso de oligonucleótidos como adaptadores, dando como
resultado el plásmido llamado pRIVET-miniTn5-ori. Teniendo en cuenta que el
vector pRIVET-miniTn5 no posee capacidad de replicarse en cepas de E. coli
que no poseen la proteína pi, la recuperación de clones que poseen el oriV
clonado dentro del sitio NotI del vector se realizó mediante la
selección de aquellos clones que poseían la capacidad de crecer en un medio
selectivo conteniendo tetraciclina, resistencia codificada por el vector. Los
clones obtenidos fueron verificados por su fenotipo, su patrón de restricción
y su secuencia. Para la nueva herramienta RIVET analizamos la capacidad de
transposición en Sinorhizobium meliloti y la funcionalidad de la resolvasa
codificada por el transposón.
Conclusiones: Hemos construido un nuevo transposón portador de un oriV
funcional en E. coli. Hemos verificado que la nueva construcción
mantiene la capacidad de transponer en S. meliloti y que, como es
esperable, en muchas de sus inserciones da lugar a escisiones del cassette
de DNA blanco de TnpR. El sistema presentado es el primero en su tipo, y
constituye una herramienta práctica muy eficiente para generar fusiones
génicas a tnpR para estudios RIVET evitando la construcción de
bibliotecas genómicas de fusión en vectores plasmídicos.