PROCESAMIENTO DE MUESTRAS DE SANGRE SEMBRADAS EN PAPELES DE FILTRO PARA LA DETECCIÓN Y CONSERVACIÓN DEL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL BOVINA

FAVARO P; CALVINHO L; MARIA JOSE DUS SANTOS; ANDREA PECORA

Congreso; XXIII reunión científico técnica de la AAVLD; 2021

INTRODUCCIÓNEn los últimos años, se han desarrollado métodos de recolección, conservación y procesamiento de muestras sembradas en papeles de filtro para el diagnóstico de distintas enfermedades infecciosas animales, como la rabia, enfermedad de Newcastle o complejo respiratorio bovino, entre otras (Liang et al., 2014; Perozo et al., 2006; Picard-Meyer et al., 2007). Los papeles llamados FTA Cards® (Flinders Technology Associates) permiten conservar el material genético de los agentes patógenos presentes en una muestra a temperatura ambiente por largos periodos de tiempo. Al mismo tiempo, lo inactivan, por lo que su manipulación durante el transporte no representa un riesgo (Cardona-ospina et al., 2019). El objetivo del presente trabajo fue desarrollar un método para el procesamiento y conservación de muestras de sangre sembradas en dos tipos de papeles para la detección del ARN del Virus de la Diarrea Viral Bovina (VDVB), así como indagar en su potencial para objetivos de biobanking.MATERIALES Y MÉTODOSSe evaluaron dos tipos de papeles: las FTA Cards®, especialmente diseñadas para preservar ácidos nucleicos; y hojas de papel cromatográfico (papeles de celulosa de 3 mm). Se contaminaron muestras de sangre con VDVB de manera que el título viral de la muestra fuera similar al de un animal persistentemente infectado (PI). Se sembraron gotas de 40 µL de sangre contaminada en papel cromatográfico y se dejaron secar a temperatura ambiente por 4 hs. Posteriormente, las gotas secas se almacenaron a temperatura ambiente (TA), 4°C, -20°C y -70°C por 1 y 7 días y 6, 12 y 18 meses. Para cada una de las condiciones de conservación, se realizaron 5 repeticiones. Para las FTA Cards®, se procedió de la misma forma que en el caso anterior, con la diferencia de que se almacenaron por períodos de tiempo más largos (12 y 18 meses).Una vez concluido el período de almacenamiento, se evaluaron distintos protocolos de elución. Para ello, se cortaron 4 discos de 6 mm de diámetro de cada gota seca con un sacabocados, que fueron colocados en tubos de 1,5 mL que contenían 220 µL de MEM (Minimun essential medium). Los tubos se llevaron a agitación durante media hora y luego se realizó la extracción de ARN con un kit comercial (Roche, Cat. 1185882001). La RT-qPCR utilizada para procesar las muestras fue adaptada a partir de una RT-PCR de punto final descripta por Monteiro et al. (Monteiro et al., 2019) utilizando los primers 189 y 389. El mismo procedimiento se llevó a cabo con muestras de sangre proveniente de dos animales PI sobre el papel cromatográfico, con tiempos de almacenamiento de 6, 12 y 18 meses a 4°C.RESULTADOSLos resultados de ambos tipos de papeles en las distintas condiciones evaluadas de tiempo y temperatura de almacenamiento se observan en la tabla 1.En las gotas de sangre de animales PI sembradas en papel cromatográfico y almacenadas a 4°C fue posible detectar ARN del VDVB hasta por períodos de 6 y 12 meses.Todas las muestras evaluadas (gotas de sangre sembradas en papeles provenientes de animales PI y sangre contaminada artificialmente para simular sangre de animales PI) almacenadas por 18 meses en ambos tipos de papeles resultaron negativas.Tabla 1. Promedio de CT para las 5 repeticiones en papel cromatográfico (a) y FTA Cards® (b) en los tiempos y temperaturas de almacenamiento evaluadas. ND: no detectado. NP: no procesado.a.CromatográficoTA4°C-20°C-70°C1 día27,1425,5825,6427,237 días28,7728,6728,4726,266 meses32,125,1224,8322,0212 mesesND2726,87NPb.FTATA4°C-20°C-70°C12 mesesND27,1128,52NPDISCUSIÓN Y CONCLUSIONESLa metodología del muestreo en papeles cobra importancia debido a las facilidades que conlleva en el muestreo a campo: por su seguridad, pueden enviarse por correo postal; no requieren refrigeración ni transporte inmediato, por lo que pueden enviarse a laboratorios distantes al sitio de toma de la muestra y agiliza el muestreo, ya que solo se necesita una gota de sangre. Además, el papel cromatográfico constituye una buena alternativa ya que su costo es muy inferior al de las FTA Cards®. Tanto el papel cromatográfico, como las FTA Cards® permitieron almacenar ARN del VDVB por hasta un año a temperaturas de 4°C o menores. Asimismo, el papel cromatográfico conservó su ARN por 6 meses a TA. De esta manera, ambos tipos de papeles demostraron capacidad de conservar ARN del VDVB.BIBLIOGRAFÍACardona-ospina, J.A., Villalba-miranda, M.F., Palechor-ocampo, L.A., Mancilla, L.I., Sepúlveda-arias, J.C., 2019. A systematic review of FTA cards ® as a tool for viral RNA preservation in fi eldwork : Are they safe and e ff ective ? Prev. Vet. Med. 172. https://doi.org/10.1016/j.prevetmed.2019.104772Liang, X., Chigerwe, M., Hietala, S.K., Crossley, B.M., 2014. Evaluation of Fast Technology Analysis (FTA) Cards as an improved method for specimen collection and shipment targeting viruses associated with Bovine Respiratory Disease Complex. J. Virol. Methods 202, 69?72. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2014.02.022Monteiro, F.L., Cargnelutti, J.F., Martins, B., Noll, J.G., Weiblen, R., Flores, E.F., 2019. Detection of bovine pestiviruses in sera of beef calves by a RT-PCR based on a newly designed set of pan ? bovine pestivirus primers. J. Vet. Diagnostic Investig. 31, 255?258. https://doi.org/10.1177/1040638719826299Perozo, F., Villegas, P., Estevez, C., Alvarado, I., Purvis, L.B., 2006. Use of FTA® filter paper for the molecular detection of Newcastle disease virus. Avian Pathol. 35:2, 93?98. https://doi.org/10.1080/03079450600597410Picard-Meyer, E., Barrat, J., Cliquet, F., 2007. Use of filter paper (FTA®) technology for sampling, recovery and molecular characterisation of rabies viruses. J. Virol. Methods 140, 174?182. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2006.11.011