• Optimización de BLS como sistema presentador de antígenos para la generación de una vacuna a subunidad polivalente para rotavirus bovino

BELLIDO D; CRAIG P; MOZGOVOJ M; GONZALEZ D; GOLDBAUM F; WIGDOROVITZ A; DUS SANTOS MARIA JOSE

BUENOS AIRES

Congreso; IX Congreso Argentino de Virología; 2008

SAV

Optimización de BLS como sistema presentador de antígenos para la generación de una vacuna a subunidad polivalente para rotavirus bovino.Bellido, Demian; Craig, Patricio; Mozgovoj, Marina; Gonzalez, Diego; Goldbaum, Fernando; Wigdorovtiz, Andrés y Dus Santos María José.La utilización de vacunas a subunidad presenta grandes beneficios frente a las vacunas convencionales, sobre todo en el marco de la seguridad y del manejo racional de epitopes. Sin embargo, este tipo de vacunas, en general, no producen una eficiente respuesta inmune frente al agente infeccioso. Para potenciar esta respuesta la estrategia más utilizada es la producción de inmunógenos de mayor grado de organización estructural, que derivan en un aumento de la inmunogenicidad. Para tal fin, en trabajos previos, hemos reportado la utilización de la proteína lumazina sintetasa de Brucella spp. (BLS). BLS presenta una estructura cuaternaria decamérica de gran resistencia la cual permite insertar dominios proteicos en sus 10 extremos amino terminales, dando como resultado proteínas quiméricas con un alto nivel de repetitividad y organización.Hemos logrado fusionar la proteína VP8 de la cepa C486 (G6P1) de rotavirus bovino, a la estructura de BLS, mediante un linker de glicinas y serinas, generando la proteína de fusión BLS-VP8. La misma resultó altamente inmunogénica y fue capaz inducir protección frente al desafío con virus infeccioso en el modelo experimental de ratón lactante. El objetivo de este trabajo es la obtención de proteínas quiméricas múltiples, uniendo a la estructura de BLS las VP8 de las cepas de rotavirus bovino C486 (G6 P1), Indiana (G6 P5) y B223 (G6 P11) que son las principales cepas circulantes en el país, mediante la utilización de péptidos heterodiméricos, a los que llamaremos Leu1 y Leu2. Estos péptidos presentan la particularidad de no poseer estructura en estado monomérico, pero en estado heterodimérico adoptan una estructura alfa hélice estable, lo cual posibilita su utilización como nexo entre la estructura de BLS, portadora del péptido Leu1 y cualquier proteína que contenga el péptido Leu2. De esta manera se pueden generar quimeras múltiples de BLS, adicionando distintas proteínas que contengan el péptido Leu2 a la misma estructura decamérica de BLS Leu1. La finalidad de este trabajo es evaluar tanto la capacidad de BLS como carrier de diversos antígenos así como también la posibilidad de generar una vacuna a subunidad polivalente frente a la infección por rotavirus bovino.Se obtuvo primeramente la proteína VP8 Leu2, con la cual se hicieron dos experiencias: por un lado se fusionó VP8 Leu2 junto con GFP Leu2 a la misma BLS Leu1. Se incubaron células Hela con la proteína quimérica y luego se observó su fluorescencia. Se vio una señal fluorescente sobre las células producida por la GFP debido a que la proteína VP8 tiene la propiedad de unirse al ácido siálico presente en las membranas celulares. Este resultado sugiere que la proteína de fusión resultante es estable y que tanto VP8 como GFP mantienen su estructura y función característica formando parte de la misma. Por otro lado, se fusionó VP8 Leu2  a BLS Leu1 para evaluar su inmunogenicidad. Se inmunizaron grupos de 8 ratones Balb/c adultos con 0,75 mg de VP8 (cepa C486), se obtuvo el suero de dichos ratones y el mismo fue analizado por ELISA y seroneutralización. El título de anticuerpos obtenidos por ELISA fue similar al obtenido previamente al inmunizar con 0,75 mg VP8 pero unido a BLS mediante el linker de glicinas y serinas. Por seroneutralización, se comprobó que los sueros neutralizan a la cepa homologa, C486 (G6P1), pero no a las heterólogas: Indiana (G6P5) y B223 (G6P11). Estos resultados demuestran que VP8 conserva su inmunogenicidad unida a BLS Leu1 y que es posible la utilización de ésta para la generación de vacunas polivalentes. Asimismo, se confirma la necesidad de contar con vacunas polivalentes para lograr protección frente a las distintas cepas de virus circulantes en el país.