Determinación de constantes de equilibrio de asociación por microscopía de fluorescencia de molécula única

MARÍA VICTORIA CAPPELLARI; DAVID GONILSKI; PEDRO F. ARAMENDÍA; LUIS FERNANDO MARCANO GARCÍA; MARÍA BELÉN ELGUERO; ALAN SZALAI; EDUARDO ARZT

Virtual

Congreso; V Reunión de Fotobiólogos Moleculares Argentinos (V GRAFOB); 2020

Grupo Argentino de Fotobiología

La microscopía de fluorescencia de súper resolución porlocalización de moléculas individuales, permite determinar laubicación de moléculas marcadas fluorescentemente, con unaprecisión lateral de decenas de nanometros [1]. Esta capacidad,posibilita el conteo molecular correlacionando sus ubicaciones en unaimagen de súper resolución, lo que permite cuantificar lainteracción molecular in situ. Esto se mide, a nivel fisicoquímico,mediante constantes de equilibrio de asociación Kas. El cálculodetallado de Kas requiere, además, el conocimiento de: i) laeficiencia de detección de cada uno de los participantes en laasociación, y ii) la definición del entorno de localización, y enparticular pero no exclusivamente, su volumen. En este trabajo, seestudian estos dos requisitos previos a través de, a) la hibridaciónde secuencias de ADN complementarias marcadas con dos fluoróforosdiferentes, comparadas entre experiencias en solución y enmicroscopía estocástica de súper resolución. b) La recuperacióndel entorno de agregación y la evaluación de las Kas de dosproteínas, marcadas en forma ortogonal con dos colores. En estecaso, se compara con simulaciones de distribuciones aleatorias,ubicadas en los mismos entornos que las imágenes reales. Primeramente, se presentarán resultados de experimentos realizadoscon oligonucleótidos [2] de veinte bases complementarios, con unahebra marcada con Alexa Flúor 647 (AF647) y otra con Cianina 3.5(Cy3.5). La evaluación de la Kas de este sistema se realizó apartir la mezcla equimolar de ambas cadenas, esparcidas endispositivos de cámara Labtek y medidos en STORM (Stochastic OpticalReconstruction Microscopy). Las experiencias se llevaron a cabo condetección simultánea de dos colores en campo dividido. A partir delconteo de cada molécula libre y cada par asociado, fue posiblecalcular la constante de asociación de los oligonucleótidos, lacual se comparó con la constante simulada. A su vez, conociendo laconcentración de sembrado, se pudo aproximar el factor dedetectabilidad de cada especie molecular.Por otro lado, se realizaron experimentos dirigidos a establecer lainteracción de proteínas relevantes en la adaptación de la hipoxiade células cancerosas. En esta oportunidad, se trabajó con célulasderivadas del riñón de mono, COS-7, transfectadas con Snap-HIF (factor inducible por hipoxia)[3], marcadas con Snap-Cell -SiR.Mediante medidas llevadas a cabo en STORM de muestras con diferentesconcentraciones del colorante, en células transfectadas y sintransfectar, se realizaron evaluaciones de los entornos delocalización. A partir de esto fue posible analizar la distribucióndel colorante en entornos celulares, comparando resultados con lassimulaciones desarrolladas para el caso. [1]Rust, M. J.; Bates, M.; Zhuang, X. Nat.Methods 2006, 3, 793.[2]Larry E. Morrison, Lucy M. Stols. Biochemistry1993, 32, 3095-3104.[3]Grosfeld, A., Andre, J., Hauguel-De Mouzon, S.,p { margin-bottom: 0.25cm; direction: ltr; color: #000000; line-height: 115%; text-align: left; orphans: 2; widows: 2 }p.western { font-family: "Calibri", serif; font-size: 11pt; so-language: es-AR }p.cjk { font-family: "Calibri"; font-size: 11pt; so-language: en-US }p.ctl { font-family: ; font-size: 11pt; so-language: ar-SA }