Informe final

FELITTI, S.A.

2010-01-01/2011-07-30

1-5

Biológica

Produccion vegetal-Pasturas

OBJETIVOS ESPECÍFICOS E HIPÓTESIS DE TRABAJO2.1 Realizar cruzamientos entre genotipos tetraploides sexuales de origen experimental, tetraploides apomícticos naturales y diploides naturales a fin de generar semillas con distintos niveles de ploidía por las vías sexual y apomíctica. 2.2 Estudiar del desarrollo del embrión y del endospermo mediante microscopía diferencial de contraste de interferencia (DIC). 2.3 Realizar un análisis del transcriptoma en el inicio del desarrollo del endospermo de semillas provenientes de apomixis y sexualidad. 2.4 Comparar los patrones de expresión génica del endospermo con los diferentes niveles de ploidías que se obtengan (por ej: 3x, 4x, 5x, 6x, 9x, 10x). 2.5 Identificar y aislar transcriptos (genes) específicos del desarrollo del endospermo de semillas apomícticas. Hipótesis: Existen diferencias de expresión en el transcriptoma de ovarios de plantas apomícticas y sexuales en el momento de la polinización y durante las primeras horas luego de producida la misma, etapa en la que normalmente se observa el inicio del desarrollo del endospermo en los sacos embrionarios. Predicción: La aplicación de técnicas de relevamiento del transcriptoma permitirá identificar genes diferencialmente expresados durante las primeras fases de formación y desarrollo de semillas originadas por apomixis y sexualidad, y contribuir a la elucidación de las bases moleculares involucradas en el desarrollo del endospermo en relación a la poliploidía y a la apomixis.  A partir del material vegetal se realizarán cruzamientos experimentales a fin de obtener ovarios polinizados (por las vías sexual y apomíctica) con distintas combinaciones genómicas matera/paterna en el endospermo. Se realizará una caracterización del transcriptoma durante el desarrollo del endospermo en P. notatum utilizando la metodología de cDNA-AFLP según el protocolo descrito por Vuylsteke y colaboradores (2007) y Xiao y colaboradores (2009). Brevemente, la preparación de ARN total se realizará a partir de al menos 20 ovarios provenientes de cada cruzamiento utilizando el kit comercial “Total RNA Isolation System” (Promega). Se analizarán ovarios a distintos tiempos (3 hs, 24 hs y 48 hs luego de la polinización) de manera de detectar diferencias en los inicios de la formación del endospermo. El ARN será utilizado como molde en reacciones de retro-transcripción con las enzimas transcriptasa reversa Superscript II (Invitrogen) y la DNA polimerasa I (Invitrogen) para obtener ADNc doble hebra. Luego se digerirá a los distintos ADNcs con dos combinaciones de enzimas de restricción, CviAII/MseI o CviAII/TaqI (New England Biolabs), se purificarán los fragmentos digeridos y se los ligará a los adaptadores correspondientes (Vuylsteke et al., 2007). Posteriormente, se procederá a la pre-amplificación seguida de la amplificación selectiva con distintas combinaciones de cebadores (Xiao et al., 2009). Los fragmentos de amplificación obtenidos serán separados en geles de acrilamida y visualizados mediante tinción con AgNO3.