El silenciamiento específico del mRNA de Z inhibe la replicación del virus Junín

ARTUSO M.C.; GARCÍA C.C.; DAMONTE E.B.

Vaquerías, Córdoba, Argentina

Jornada; XXVII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2007

Sociedad Argentina de Virología

Varios miembros de la familia Arenaviridae, entre ellos, los virus Junín (JUNV) y Lassa, causan fiebres hemorrágicas en humanos. Los viriones contienen 2 fragmentos de RNA simple con estrategia codificante ambisentido, que codifican para 5 proteínas: la nucleocápside, las glicoproteínas GP1 y GP2, la RNA polimerasa L y una pequeña proteína que contiene un motivo RING finger, llamada Z. La conservación de este motivo entre los distintos arenavirus hace que Z sea un atractivo blanco para la quimioterapia antiviral. A pesar de los considerables avances que hemos realizado, tanto nosotros como otros grupos de investigación, se desconoce la exacta localización y función de la proteína Z, aunque se sabe que es esencial dentro del ciclo viral. En la búsqueda de nuevas herramientas para estudiar el rol de esta proteína, el presente trabajo propone el uso de pequeños RNAs interferentes (siRNAs) dirigidos hacia el mRNA de Z (Z-siRNAs) para inhibir específicamente su expresión, y así poder inferir su función. Para dicho estudio se eligieron 4 secuencias distintas (Z1, Z2, Z3 y Z4) basadas en los programas algorítmicos disponibles y se evaluó la acción antiviral de las mismas a nivel de síntesis de mRNA, proteínas y formación de partículas virales. En primer lugar, se transfectaron células Vero con los diferentes Z-siRNAs y luego se infectaron con JUNV. A las 24 h p.i se cosecharon los sobrenadantes para cuantificar el título viral obtenido, y simultáneamente se procesaron las células para extracción de RNA y posterior qRT-PCR. En los resultados se observó una eficiente inhibición de la replicación viral monitoreada con primers específicos para la amplificación del gen z, y una inhibición en la formación de placas en las células que recibieron los Z-siRNAs denominados Z2 y Z4. Por otro lado, se analizó la expresión de la proteína Z recombinante (pcDNA-Z) mediante una inmunofluorescencia indirecta, observándose un reducido número de células que expresan el antígeno viral en células cotransfectadas con el pcDNA-Z y los mencionados Z2 y Z4-siRNAs. Para evaluar la especificidad de los interferentes, se los utilizó para intentar inhibir la replicación de un virus antigénicamente relacionado, el virus Tacaribe (TCRV) cuyo Z-mRNA posee un 85% de homología. Para ello, se transfectaron células Vero con los diferentes Z-siRNAs y luego se infectaron con TCRV. Luego de la titulación de los sobrenadantes, cosechados a las 24 h p.i, se verificó que no hubo ninguna inhibición en la replicación de estas particulas virales. Estos resultados indican que el silenciamiento del mRNA de Z por siRNAs permite bloquear la multiplicación de JUNV, y que el uso de siRNAs como herramientas para el estudio de Z como blanco antiviral es de gran importancia debido a la especificidad de estas moléculas.