El método de extracción de ADN puede afectar el diagnóstico molecular de Artritis Encefalitis Caprina empleando Nested PCR

LAURA LOZANO CALDERON; SEBASTIAN RECCE; MARENGO RAFAEL; ANDREA PERALTA

Encuentro; XVI Encuentro Nacional y IX Internacional de Investigadores de las Ciencias Pecuarias; 2021

Universidad de Antioquia (Colombia) y ENICIP

Antecedentes: LosLentivirus de pequeños rumiantes (SRLV) son considerados un grupo génico condos integrantes, el virus Maedi Visna (MVV) y virus de la Artritis EncefalitisCaprina (CAEV). Los SRLV infectan monocitos y macrófagos y se integran en elgenoma como provirus. Actualmente, la Nested-PCR basada en el gen gag-pol (Gregoy col) permiterealizar un diagnóstico molecular certero para CAEV así como también la clasificaciónen genotipos virales. Objetivo: Evaluar dosdiferentes métodos de extracción de ADN a partir de PMBC posiblementeinfectados con CAEV para su uso en ensayos de PCR diagnostica Métodos: Se tomaron 10ml desangre de 40 caprinos provenientes de la provincia de Santa Fe, Argentina. Seseparó el plasma de la fracción celular y se procesaron con buffer de lisis deglóbulos rojos para obtener únicamente la población linfocitaria. Al buffy coatobtenido se lo separó en dos alícuotas. En la primera, el ADN se extrajo por medio delmétodo Dellaporta, mientras que en la segunda el ADN se extrajo usandoel método clásico de Proteinasa K y fenol-cloroformo. Posteriormente se llevó acabo la  Nested-PCR y los productos obtenidos se resolvieronen un gel de agarosa al 1%. Losamplicones se purificaron y fueron enviados a secuenciación Resultados: En todas las muestras analizadas, el método de extracción Dellaportadio como resultado ADN de mejor calidad e integridad que el obtenido con elmétodo clásico de extracción. En la Nested-PCR realizada con los ADN extraídosmediante el método Dellaporta, se observó amplificación de fragmentosde 800pb (congruentes con el control positivo) en 16 muestras. Por otro lado, enla Nested-PCR, usando el ADN obtenido con el  método clásico, no fue posible evidenciar lapresencia de bandas. Una vez se obtuvo la secuencia de las 16 muestrasaparentemente positivas (Dellaporta), se pudo observar que las amplificaciones nose debían a la presencia del provirus CAEV en las muestras, sino quecorrespondía a una amplificación no esperada de un gen endógeno. Conclusiones: El uso del método Dellaporta para extracción de ADN, afecta eldiagnóstico molecular de CAEV al realizar Nested PCR basada en el gengag-pol.