Desarrollo de partículas semejantes a virus basadas en la proteína VP6 de rotavirus como sistema de presentación de antígenos heterólogos

PERALTA ANDREA; LOPEZ M. GABRIELA; TABOGA OSCAR

Buenos Aires

Congreso; VII Congreso Argentino de Virología; 2002

Sociedad Argentina de Virología

El objetivo general del proyecto es evaluar el empleo de partículas semejantes a virus (VLPs) basadas en la proteína VP6 de rotavirus como sistema de presentación de antígenos heterólogos. La razón principal por la que se intentó crear VLPs quiméricas para su empleo como vacunas es la notoriamente baja inmunogenicidad de péptidos libres. Debido a la estructura espacial de las VLPs, los sitios antigénicos son presentados al sistema inmune de manera multimérica, asociados a proteínas inmunogénicas. Además, estas VLPs no replican y no son infecciosas. VP6 tiene 422 aminoácidos y es la proteína mayoritaria de los rotavirus. Esta proteína es capaz de autoensamblarse en partículas esféricas y láminas tanto en su forma nativa como expresada como proteína recombinante. Además, mediante acoplamiento químico con diferentes proteínas o epitopes derivados de rotavirus o herpes bovino tipo 1, se demostró que estas esferas de VP6 fueron efectivos transportadores inmunológicos. Con el objeto de investigar los posibles sitios de inserción de secuencias foráneas en la proteína VP6, se eligió el sitio antigénico A del virus de la fiebre aftosa (VFA). Mediante la utilización de algoritmos que permiten analizar la hidrofilicidad de una proteína y los sitios expuestos al solvente, se seleccionaron seis posibles sitios de inserción de epitopes foráneos. Ellos corresponden a las posiciones aminoacídicas 14, 101, 146, 235, 382 y la posición N-terminal. A través de mutagénesis dirigida por PCR se insertó un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción XbaI en la secuencia de VP6 que permitió el clonado posterior del epitope foraneo (sitio A del VFA), originando así las distintas versiones VP614, VP6101, VP6146, VP6235, VP6382  y VP6Nterm. Las proteínas quiméricas fueron expresadas en el sistema baculovirus-células de insecto y se obtuvieron altos niveles de expresión para todas las versiones ensayadas. Se realizaron extracciones proteicas en buffers no desnaturalizantes y Western blots (en condiciones no reductoras) para determinar la formación de trímeros como una aproximación para evaluar la capacidad de las diferentes proteínas quiméricas VP6-VFA de mantener la propiedad de multimerización en VLPs. La versión VP614 es capaz de formar trímeros, pero no es reconocida por un suero policlonal anti-VP6, mientras que sí lo es por un pool de anticuerpos monoclonales anti-sitioA, indicando que mediante la inserción se está interrumpiendo un sitio antigénico importante de la proteína VP6. La versión VP6235 no es capaz de formar trímeros, indicando que no es posible insertar epitopes foráneos en esta posición aminoacídica sin afectar la multimerización de esta proteína. Las versiones restantes son capaces de formar trímeros y son reconocidas por el suero policlonal anti-VP6 y por el pool de anticuerpos monoclonales anti-sitioA. En este momento se está evaluando la inmunogenecidad de las diferentes construcciones.