Obtención de una línea celular establemente transformada con el gen de la poliderina del virus de la poliedrosis nuclear Autographa californica.

BARBIERI ROSARIO; PERALTA ANDREA; LOPEZ M. GABRIELA; CARRILLO ELISA; TABOGA OSCAR

Buenos Aires

Congreso; VII Congreso Argentino de Virología; 2002

Sociedad Argentina de Virología

El virus de la poliedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) pertenece a la familia Baculoviridae, es un virus ADN de doble cadena y produce infección en lepidópteros. Es utilizado como un eficiente vector de expresión eucariota y se han descrito distintos sitios en su genoma para la inserción de genes foráneos, entre ellos el locus poliedrina que permite la sobreexpresión de las proteínas recombinantes. El ciclo de vida es bifásico. En la etapa temprana de infecciónel virus se dirige hacia la membrana plasmática y brota de la célula infectada dando origen a partículas virales extracitoplasmáticas denominadas virus brotado (BV). Estas partículas virales transmiten la infección desde el intestino de la larva hacia otros tejidos del mismo individuo, pero son capaces de propagarse naturalmente a otros. La segunda forma de progenie viral, denominada virus ocluido (VO), se produce en las etapas tardías de la infeción. En este caso, las nucleocápsides se encuentran ocluidas en una matriz proteica formada esencialmente por poliedrina y son capaces de infectar insectos por vía oral. En nuestro laboratorio hemos generado distintos baculovirus recombinantes en el locus poliedrina incapaces de formar cuerpos de oclusión durante la infección de células Sf9 en cultivo. De la necesidad de producir proteínas recombinantes en cantidad compatible con grandes ensayos surge la idea de infectar larvas de lepidópteros por vía oral para reducir los altos costos de su producción en cultivos celulares. El objetivo general del proyecto es desarrollar la metodología necesaria para generar baculovirus recombinantes pol- incluidos en una matriz de poliedrina capaces de infectar larvas por vía oral eficientemente. En el presente trabajo, se describe los pasos iniciales en la construcción de lineas celulares establemente transformadas con el gen completo que codifica para la proteína baculoviral poliedrina, hipotetizando que la expresión del gen de poliedrina bajo el control de su propio promotor será inducida por factores virales en trans duarnte las estapas tardías de la infección con baculovirus recombinantes. En el plásmidopIB-V5His se reemplazó el promotor constitutivo por el gen completo de poliedrina y secuencias regulatorias específicas, dando lugar al plásmido pPPOL. Con este plásmido se transfectaron células de la linea Sf9 y se seleccionaron las células transformadas por incubacióncon al antibiotico blaticidina, previa determinación de la concentración inhibitoria minima. Luego de cinco pasajes en medio selectivo, la presencia del gen se determinó mediante analisis de Southern blot y PCR. La inducibilidad del gen poliedrina se midió a través de ensayos de Northern blot de las líneas establemente transformadas luego de ser infectadas con baculovirus recombinantes, tomando como nivel basal la expresión de este gen en las lineas sin infectar.