Expresión de la proteína diagnóstica 3AB1 del VFA en larvas de leidópteros.

LOPEZ M. GABRIELA; PERALTA ANDREA; BARBIERI ROSARIO; GOLDBERG ALINA; TOZZINI ALEJANDRO; TABOGA OSCAR

Buenos Aires

Congreso; VII Congreso Argentino de Virología; 2002

Sociedad Argentina de Virología

Durante las campañas de erradicación dela Fiebre Aftosa resulta muy conveniente contar con herramientas para diferenciar animales vacunados de infectados. La proteína no estructural 3AB1 del virus de la fiebre aftosa (VFA) mostró una gran sensibilidad y especificidad en test de ELISA y Western blot cuando fue expresada en el sistema baculovirus-células de insecto. Este sistema es ampliamente usado como sistema de expresión eucarionte, la construcción de la mayoría de los baculovirus recombinantes se basa en el reemplazo del gen de la poliedrina por la secuencia de interés. Los baculovirus resultantes expresan altos niveles de proteína recombinante y son fenotípicamente poliedrina (-). L aproducción en gran escala de proteínas foráneas en el modelo in vitro resulta muy costoso, a diferencia del modelo in vivo de larvas de insecto. Sin embargo, los baculovirus poliedrina (-) no son infectivos per os el método más práctico de la infección masiva de larvas. Una manera de salvar este inconveniente se basa en la realización de coinfecciones de células Sf9 con baculovirus wt y recombinantes, usando los poliedros mixtos resultantes como inóculos para infectar larvas per os. Los objetivos de este trabajo son establecer las condiciones óptimas de coinfección de células Sf9 mediante el análisis de la influencia de la relación de multiplicidad de infección (moi) en la formación de poliedros mixtos, evaluar en que grado su composición determina la cantidad de baculovirus recombinantes y proteína foránea recuperados de larvas infectadas per os y determinar la capacidad de la proteína recombinate 3AB1 fusionada a un oligopéptido de histidinas (3AB1-his) para diferenciar animales vacunados de infectados con la misma especificidad que la de la proteína expresada en células Sf9. Para ello, se infectaron células Sf9 con los baculovirus wt AcNPV y el baculovirus recombinates 3AB1-his a distintas relaciones de moi. A los 5dpi se cosecharon las células y cuantificaron los poliedros resultantes. El ADN extraído de poliedros se sometió a PCR cuantitativa con primers especialmente disañados para tal fin, con el objeto de determinar la proporción relativa wt:recombinante que forman esos poliedros mixtos. Con los diferentes polideros se infectaron oralmente larvas de Rachiplusia un y Spodoptera frugiperda y a los 4 días post-infección se extrajo ADN total. Nuevamente, se determinó la proporción relativa wt:recombinante dentro de la larva y la cantidad de la proteína recombinante recuperada. Los resultados mostraro que las condiciones óptimas de coinfección de células Sf9 son aquellas en las que la proporción de moi son 1:10 (wt:Ac3AB1-his). Asimismo, se demostró que la proporción de ambas poblaciones tiene influencia en la proporción final en la larva infectada y en la cantidad de proteína recombinante obtenida. Finalmente, se comprobó que la proteína 3AB1-his obtenida en larvas infectadas per os es completamente funcional para diferenciar aniamles vacunados de infectados con el VFA en ensayos de ELISA o Western blot, mostrando que la infección oral de larvas puede constituir un método eficaz y económico para la producción masiva de esta proteína.